采用农杆菌介导法进行AaDFR基因对蝴蝶兰类原球茎及拟南芥等材料的转化，筛选抗性类原求茎和转化植株并进行鉴定，对获得的转基因植株进一步低温胁迫处理，分析其花青素积累特征和叶色变化，为进一步培育改变花色的蝴蝶兰优良新品种提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料及其培养基 2
1.2蝴蝶兰和拟南芥材料的培养 2
1.2.1蝴蝶兰类原球茎材料的获得2
1.2.2类原球茎诱导2
1.3农杆菌培养2
1.4AaDFR基因对蝴蝶兰的遗传转化2
1.5AaDFR基因对拟南芥的遗传转化3
1.6抗性植株筛选和PCR及RTPCR鉴定 3
1.7转基因拟南芥植株低温处理和叶色观察3
2结果与分析3
2.1 不同农杆菌培养方式对菌液制备的影响3
2.2 侵染菌液浓度的选择4
2.3不同蝴蝶兰材料对遗传转化的影响4
2.4拟南芥转化植株的PCR检测5
2.5拟南芥转化植株叶色变化特征分析5
3.讨论6
致谢7
参考文献7
花烛AaDFR基因对蝴蝶兰和拟南芥的遗传转化研究
引言
蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属（Phalaenopsis）花卉，因其花型酷似蝴蝶，因而得名。蝴蝶兰是近年来在我国及国际花卉市场中备受青睐、发展较快的花卉之一。因其色彩绚丽，花色丰富，花期长，花姿优雅，素有“兰花皇后”的美誉。蝴蝶兰用途广泛，是赠人佳品，同时也是贵宾胸花、新娘捧花、花盆插花的高档素材。蝴蝶兰属单轴性兰，只有一个生长点，不像其他大多数兰花可以分株繁殖。在自然生境中，其种子难以发芽，属于珍稀植物，所以显得弥足珍贵[1]。进入20世纪80年代，生物技术在蝴蝶兰上的成功应用，实现了蝴蝶兰的工厂化生产，近些年国内蝴蝶兰产业蓬勃发展，将这一热带奇葩送进千家万户。
目前，蝴蝶兰的花色问题是个研究的热点，花色的发展可以使得蝴蝶兰变得更美，更受青睐。当前杂交育种依 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
然是蝴蝶兰新品种选育的主要手段，其杂交品种非常多，多数花色、花型均有，如白花、紫红花、黄花红斑、红点、红线、纯黄、白花红心等。但目前仍缺少深红色品种，且常规杂交育种周期较长，从人工杂交授粉，到种子无菌播种，再移栽，再到开花并筛选优良单株进行组培扩繁等步骤，需要35年时间。而利用转基因技术，分离其他植物中的花色关键基因，转入蝴蝶兰，可以使得蝴蝶兰获得新型的花色，丰富不同花色的品。
植物花器官的颜色主要由类黄酮色素、类胡萝卜素及甜菜色素等决定，还受到色素细胞的pH值、金属离子、辅助色素及花瓣表皮细胞形态等因素的影响，目前已能够利用分子生物学技术，通过转基因技术进行植物花色的改良。本实验采用根瘤农杆菌介导法进行遗传转化，根癌农杆菌带有Ti(Tumour inducing)质粒，其上有一段TDNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法进行植物基因转移的理论基础。关于蝴蝶兰的花色基因问题，国内外已有学者进行相关研究，并获得很多成功的经验可供参考[23]。目前主要集中于花色素苷合成途径中的关键基因的分离与鉴定方面，这些基因也将是蝴蝶兰转基因研究方面的重点。
花烛品种‘Sonate’叶色突变体，其苞片颜色由粉色变为深红色，基因表达分析表明，花青素合成关键基因DFR在该突变体中起重要作用，目前已克隆该基因，拟进一步转化蝴蝶兰，促进深红色蝴蝶兰新种质的培育，外源基因如能正常表达，有望改良蝴蝶兰红色色素积累过程。因此，本研究拟采用花烛中克隆的红色色素合成关键酶基因AaDFR，构建表达载体，转化蝴蝶兰类原球茎，并通过转化模式植物拟南芥，筛选抗性植株，并进行转基因植株花青素积累特征的分析，为培育花色呈现深红色的蝴蝶兰新种质，丰富蝴蝶兰品种类型，也为深入理解植物花青素合成途径关键基因的表达特征提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其培养基
供试材料为蝴蝶兰Ph 4×7类原球茎，类原球茎材料为杂交后代种子无菌播种群体中的单个株系诱导和增殖形成的类原球茎。基本培养基为MS培养基附加3 %蔗糖与0.7%琼脂(pH 5.6)。农杆菌培养用培养基为YEB固体培养基 + 卡那霉素（Kan） 50 mg/ml + 利福平（Rif） 40 mg/ml（pH 7.0）; 共培养培养基为 1/2MS培养基 + 椰汁 + AS(乙酰丁香酮) 50 umol/L；筛选培养基为 1/2MS培养基 + 椰汁 + 替卡西林（100 mg/L + 潮霉素 1030 mg/L；增殖培养基为 1/2MS 培养基 + 1.0 mg/L 6BA 。
1.2 蝴蝶兰和拟南芥材料的培养
1.2.1 蝴蝶兰类原球茎的增殖
以蝴蝶兰杂交组合‘Ph 4X7’杂交后代果荚经1％的次氯酸钠表面无菌后，接种于添加香蕉泥的MS培养基，萌发生长20d的原球茎进一步生长，从中挑选单一原球茎接种于添加6BA 1.0 mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基进行增殖，获得大量类原球茎，用于AaDFR基因的转化。此外，通过花粉块农杆菌侵染后授粉，后代种子无菌播种形成的原球茎进行部分转化。
1.3 农杆菌培养
供试菌株为携带有AaDFR基因的农杆菌，采取两种方式培养：（1）挑取携带有AaDFR基因的农杆菌单菌落，该单菌落来自保存于80℃冰箱中携带AaDFR基因的农杆菌菌种，菌种于平板培养基活化，在28℃培养3648h后获得。（2）吸取保存于80℃的甘油中且已转入AaDFR基因的农杆菌保菌液体300 uml。
将上述方法获得的菌种接种于20 ml YEB液体培养基，置于28℃恒温摇床培养用于蝴蝶兰受体材料的侵染和共培养。200 rpm过夜暗培养至菌液呈橙黄色，在600nm下测量OD（吸光值）为11.5可用, 之后分装入离心管离心后弃去上清液（两次），加1/2MS，将OD（吸光值）稀释为0.6左右（另一种方法为稀释至0.3左右），加入AS。

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