目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 植物材料 2
1.2 胚胎败育相关基因Cm2S的克隆2
1.2.1 植物总RNA提取以及cDNA的合成2
1.2.2 定量检测结果4
1.2.3 基因克隆过程4
1.3 Cm2S基因亚细胞定位分析5
1.3.1构建亚细胞定位的表达载体5
1.3.2基因枪法进行亚细胞定位7
2 结果与分析7
2.1 Cm2S基因的克隆和表达分析7
2.1.1总RNA以及cDNA的质量检测7
2.1.2获得Cm2S的全长序列8
2.1.3基因Cm2S组织特异性的表达分析8
2.2胚胎败育相关基因Cm2S的克隆9
2.2.1 构建表达载体9
2.2.2亚细胞定位分析10
3 讨论 10
3.1 Cm2S的功能分析10
致谢11
参考文献11
胚胎败育相关基因Cm2S基因
的克隆及功能分析
引言
引言 植物胚胎的正常发育是杂交育种得到种子的关键，是产生性状优良植株的前提。菊花(Chrysanthemum morifolium)原产我国，是具有观赏价值的草本植物，具有较高的观赏和经济价值，广泛应用在鲜切花、园林造景、盆栽、庭院栽培等方面，具有广阔的消费市场。但多数菊花品种的抗逆性比较差，严重限制了菊花品质和产量的提高[1]，影响其推广应用，因此在现阶段的菊花生产中，选育观赏性状优良且抗逆性强的新品种尤为必要。近年来，国内外采用的菊花育种方法有人工杂交、自然杂交、芽变选种、基因工程、辐射诱变等，其中杂交育种是最为普遍使用、最有成效的一种方法。目前，菊花品种抗性的改良常通过栽培菊与菊属及其近缘种属的远缘杂交来实现，从而将野生资源的优良基因导入栽培品种，提高栽培菊的抗病虫性、耐热性、抗旱性、抗寒性等，是进行菊花抗性的种质创新以及新品种选育的一个重要途径[2]。近几年来，在这 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
方面开展了大量的工作，但发现在远缘杂交种中经常会存在胚胎败育的现象[3]。植物胚胎败育的现象在许多植物中是普遍存在的,关于胚胎败育的原因研究也一直是植物学领域的热点[4]。许多育种实验表明，远缘杂交在许多情况下都难以成功，原因包括各物种间存在有不同程度的生殖隔离、不同源的遗传信息、不尽相同的遗传物质、不协调的发育进程、不一致的生理反应以及器官形态上的一些差异等等[5]。通过菊花远缘杂交的育种研究发现了栽培菊和菊花脑进行种间杂交会存在结实率低的现象，其中一个重要的原因可能就是雌配子体以及胚胎发育相关过程中出现的大量败育现象[6]。而且迄今为止的研究中，与胚胎败育有关的机理尚不清楚，从而严重影响了菊花野生资源的利用以及育种效果。因此，通过对菊花胚胎发育调控基因的功能和作用机制进行研究，将为其今后的遗传育种工作提供理论性的指导。目前，有关植物胚胎发育调控基因的功能与作用机制的研究主要集中在拟南芥、水稻等农作物或模式植物中。
菊花的胚胎发育大致经历原胚期、球形胚心形胚过渡时期、器官形成和成熟期三个时期，包括从双受精开始一直到种子成熟的过程[7]。胚胎发育是形成植株的前提，植株个体的雏形就是成熟胚。植物胚胎的发生包含一系列受控的细胞分裂及分化，受到非常精确的遗传调控[8]。多年以来，科学家们对影响植物胚胎发育的基因开展了广泛的研究,发现了其中一些与胚胎早期形态建成相关的基因[9]。结合相关的分子生物学技术，科学家们克隆获得了许多与胚胎发育有关的重要基因，得到了大量的植物胚胎发生突变体，并对植物胚胎发育产生影响的基因开展了一系列的研究。通过对突变体的分析以及基因的克隆技术，已经在模式植物拟南芥上成功分离和鉴定到了某些与胚分生组织的发育成熟有关的基因。
在此基础上，我们针对菊花远缘杂交中的胚胎败育现象进行了深入的研究，希望能在分子水平上得到胚胎败育原因的解释。研究发现菊花的胚胎败育是属于细胞程序性死亡，并且获得了一些与胚胎败育有关的关键 miRNA、蛋白以及基因，如Cm2S基因，发现该基因与菊花胚胎发育密切相关，但其作用机制尚不清楚。为此，本项目在良好研究的基础上，采用PCR技术对Cm2S基因进行克隆，并进行了载体构建、亚细胞定位和定量分析等工作。结果将揭示Cm2S调控菊花胚胎发育的部分作用机制，为菊花远缘杂交之后的胚胎发育分子设计育种方面提供优良基因储备和理论基础，实现利用基因调控技术来降低胚胎败育率。因此，本研究具有很重要的科学意义和广泛的应用前景。
1 材料与方法
1．1 植物材料
植物材料选择栽培菊‘雨花落英’（一种地被菊）及野生菊四倍体菊花脑，取两者杂交后正常发育与败育的胚胎作为本次实验的样本，用于RNA的提取及一系列后续实验。
1．2 胚胎败育相关基因Cm2S的克隆
1．2．1 植物总RNA提取以及cDNA的合成
以杂交后代的胚胎样本为材料提取总RNA，并进行反转录得到cDNA。方法采用Trizol法，通过琼脂糖凝胶电泳对提取到的RNA进行质量检测；并取1 μl的总RNA，利用核酸仪对其浓度和质量进行测量。采用Trizol法进行RNA提取的步骤如下：
（1）经过高温处理的研钵以及研杵都冷却到室温，然后利用液氮进行预冷作为备用。
（2）选取大约0.20.3 g的样品放置于研钵内，小心谨慎地倒入适量液氮，再利用研杵对样品进行不断研磨，过程中需要不断添加液氮，直到磨成粉末状。

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