盐胁迫条件严重影响着大豆的生长发育。本实验采用砂培的方法，以转StNHX1基因菜用大豆（T4）为实验材料，研究了在50 mmol/L NaCl盐胁迫下转StNHX1基因过表达对菜用大豆植株结瘤固氮的影响。结果显示（1）盐胁迫下，转基因植株的生长情况、根瘤的发育以及单株的种子重量均要优于野生型植株（WT）。（2）盐胁迫下，转基因植株叶片中Na+含量以及MDA含量均低于野生型植株，相反，K+以及脯氨酸含量、相对叶绿素含量、相对水含量均高于野生型。（3）盐胁迫下，转基因植株的全氮、豆血红蛋白含量以及谷氨酰胺合成酶活性均要高于野生型植株。（4）盐胁迫下，转基因植株中5个结瘤固氮相关基因（GmENOD40-1, GmENOD40-2, GmLba, GmGS1β1和GmGS1β2）的相对表达量均要高于WT植株。以上结果表明过表达StNHX1基因能够提高菜用大豆的耐盐性，并且在盐胁迫下，能够提高菜用大豆的结瘤固氮能力。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验设计 3
1.3转基因植株PCR鉴定 3
1.4生长及结瘤指标测定 3
1.5生理生化指标测定 3
1.6 StNHX1及结瘤相关基因RTPCR分析3
1.7数据分析3
2结果与分析4
2.1转基因植株检测 4
2.2植株生长和结瘤表现 4
2.3盐胁迫下植株Na+、K+、MDA、脯氨酸、相对叶绿素含量比较6
2.4盐胁迫下植株谷氨酰胺合成酶活性、全氮、豆血红蛋白含量比较 7
2.5结瘤固氮相关基因的表达8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
耐盐转StNHX1基因菜用大豆在盐胁迫下共生固氮效果的研究
引言
盐渍化土壤在我国1.2亿公顷的耕地中占到了将近1/10，在高盐胁迫下，植物的生理代谢、离子吸收、光合作用等等都受到严重影响，它已经成为影响作物品质和产量的一个重要因素 [1]。菜用大豆 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
[Glycine max (L.) Merr.]作为一种具有经济价值、营养价值高的特色蔬菜，颇受东南亚乃至西方国家消费者的喜爱，含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质、膳食纤维等营养物质[2]。但随着盐渍化的加重，菜用大豆的生产受到了严重影响。因此，培育耐盐新品种，有效合理利用盐土，有利于农作物的稳产稳收。
豆科植物能与根瘤菌形成根瘤，吸收转化大气中的氮,豆科植物与根瘤菌形成的固氮体系是所有固氮体系中效率最高，应用最为广泛的[3]。在N不足的情况下，根瘤菌能够固定大气中的N2，转化成为含氮化合物提供给植物，这个体系可产生每年高达2000～2200万吨的有机氮[4]。全世界每年大概要使用5亿顿氨氮肥料，来维持全球40%人口的需求；然而，使用这些肥料所带来的环境成本不再是可持续的了，营养过剩情况在中国、美国、欧洲西部等国家尤其严重，农业环境污染问题形势严峻[5]。充分利用以及开发大豆根瘤菌共生体系在固定N2方面具有优越性，从而减少实际生产对氮肥的依赖和自然资源的过度开采，实现绿色环保、可持续农业。
大豆是一种盐敏感植物[6]。根毛区的侵染与根瘤的形成对盐胁迫十分敏感，导致豆科植物极易受到土壤盐害的影响；盐害严重影响了植物根瘤的形成和发育，根瘤的数目以及干物质量有着明显的下降[7]。盐胁迫下，豆科植物与根瘤菌之间的共生关系受到了极大影响，固氮酶的活性降低，固氮效率明显降低[8]。在无土栽培的情况下，轻度的盐胁迫可迅速抑制大豆固氮能力以及根瘤菌的呼吸作用，导致根瘤吸收O2受阻，呼吸熵与乙醇含量上升。盐胁迫下，植株根瘤中的豆血红蛋白含量下降，导致根瘤菌的固氮能力减弱[9]。
植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在离子区隔化和离子稳态平衡中起到重要作用：植物受到盐害时，体内的Na+含量上升，Na+积累过多对植物会造成伤害；然而，通过Na+/H+逆向转运蛋白可以将细胞质内多余的Na+排除体外或区隔化到液泡中来，以维持细胞质中离子平衡[10]。Gaxiola等成为首次成功的从植物中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白基因的研究者[11]。2016年，Prasad等将拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因导入到绿豆基因组中，超表达的转StNHX1基因绿豆能够在盐胁迫条件下正常生长发育[12]。国内在大豆转基因抗逆方面的研究颇多，而耐盐转StNHX1基因菜用大豆在盐胁迫下共生固氮效果的研究尚属空白。本研究的实验材料是本实验室将野生茄子中的Na+/H+逆向转运蛋白基因导入菜用大豆中，经过长期不断地繁殖、筛选得到了稳定遗传的后代转基因株系。探究在盐胁迫下StNHX1基因的过表达对菜用大豆的生长发育以及结瘤固氮的影响，以期达到提高根瘤菌结瘤固氮的效果。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1试验材料
本实验室已获得的3份T4代转StNHX1基因株系菜用大豆材料，编号分别为15N1、15N2和15N3。以其转化受体品种‘新辽鲜’为对照，购于南京理想种业有限公司。日本慢生根瘤菌NAU1301,由本实验室分离保存。
1.2试验设计
采用砂培法，用95%的酒精对菜用大豆种子进行消毒，无菌水淋洗，于培养皿内事先铺好无菌水浸湿的滤纸，后将种子置于培养皿内，25℃避光催芽。主根长至2～3 cm时，用日本慢生根瘤菌侵染20 min。最后将接种根瘤菌的幼苗移栽到含有灭菌砂石的周转箱（32 cm×22 cm×12 cm）内培养，每箱5株重复3次，每隔3 d浇一次无氮营养液,温室环境人工控制：昼夜温度，28/20℃；光周期：16 h光照/8 h黑暗；光照强度：600800 μmolm2s1 ;相对湿度70%80%。 等幼苗生长至第7 d时，用含有盐浓度50 mmol/L NaCl的营养液处理，每3 d淋洗一次以防盐分的积累。盐处理3周后停止处理，进行各项指标的测定，于95 d后收获种子。
1.3转基因植株PCR鉴定
取新鲜幼嫩的叶片0.1 g，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA。StNHX1基因PCR扩增引物序列为：正向引物（PF1）5’GTGGCGAGATTGGGGGTCAGTA3’,反向引物（PR1）5’CCAGTGAACAATAAGGCAGCCC3’，产物长度1599bp。PCR扩增体系为20 μL：Premix Taq酶10 μL，正反引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,共30个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统拍照。

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