PI基因是MADS-box家族B功能基因，在花发育过程中，和AP3基因共同调控植物花瓣和雄蕊的发育。本研究从‘月月粉’花器官中分离出了两个PI亚家族基因——RcPI3和RcPI4，RcPI3基因全长624bp，编码207个氨基酸，RcPI4基因全长612bp，编码203个氨基酸，两个基因均具有MADS结构域、K结构域和含有PI基序的C端。系统进化树分析表明RcPI3和RcPI4聚类到B功能基因PI亚类。取基因上游1500bp的序列进行启动子分析，发现其响应元件存在差异。采用QRT-PCR的方法分别对百叶蔷薇、‘绿萼’和‘月月粉’的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊中RcPI3、RcPI4基因的表达水平进行分析。结果表明，无论在蔷薇和月季中，PI-like基因主要在花瓣和雄蕊中表达。但其在花瓣和雄蕊中的表达趋势存在显著差异，即在蔷薇中，RcPI3和RcPI4在雄蕊中的表达量高于花瓣中的表达量；而在月月粉中，这两个基因在花瓣中的表达量高于其在雄蕊中的表达量。由此推测，RcPI3和RcPI4可能在参与调控蔷薇和月季之间花器官形态建成中存在差异。另外，RcPI3基因在‘月月粉’雄蕊中的表达量低于其在花器官突变体‘绿萼’的雄蕊中的表达量，而RcPI4基因在‘月月粉’雄蕊中的表达量却高于‘绿萼’雄蕊的表达量，说明这两个PI-like基因在月季雄蕊的形态发生和发育过程中存在功能上的分化。此外，本研究还构建了RcPI3和RcPI4基因的VIGS载体，并采用农杆菌介导法获得了RcPI4基因沉默的转化植株，为了该基因进一步的功能验证奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 实验试剂及耗材3
1.1.3 实验仪器3
1.2 实验方法3
1.2.1 RNA提取3
1.2.2 第一链cDNA的合成 4
1.2.3 RcPI3、RcPI4特异性产物获得4
1.2.4 目的条带的纯化和回收4
1.2.5 特异性产物测序5
1.2.6 实时荧光定 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
量PCR反应5
1.2.7 pTRV2载体的构建6
2 结果与分析8
2.1 特异性扩增产物的获得8
2.2 序列同源性分析及蛋白序列对比8
2.3 系统发生分析 10
2.4 启动子分析10
2.5 QRTPCR结果分析 12
2.5.1在蔷薇属不同品种中RcPI3、RcPI4基因表达量差异12
2.5.2‘月月粉’和‘绿萼’中RcPI3、RcPI4基因表达量差异对比 13
2.5.3‘月月粉’和百叶蔷薇中RcPI3、RcPI4基因表达量差异对比14
2.6 pTRV2载体的构建和转基因植株的获得15
2.6.1含干扰片段pTRV2质粒构建15
2.6.2 含有pTRV2载体农杆菌鉴定17
2.6.3 农杆菌介导侵染月季步骤优化17
2.6.4 转基因植株的获得18
3 讨论 19
3.1 RcPI3、RcPI4基因同源性19
3.2 RcPI3、RcPI4表达水平品种间差异19
致谢 20
参考文献 20
月季PIlike基因在花器官发育中的功能研究
引言
引言
月季隶属蔷薇科蔷薇属，是多年生常绿或落叶灌木，至今已有300多年的驯化栽培历史，观赏其造型独特，颜色丰富，具有较高的观赏价值。月季不仅仅可作为切花和园林造景，还具有一定的药用价值，月季中没食子酸乙酯、琥珀酸、原儿茶酸等提取物在抗肿瘤、抗真菌和抗氧化衰老方面有良好作用[1]。月季作为优良的观赏植物和药用植物，对其研究有着重要的意义。
迄今为止，月季包含超过150 种野生品种和数千种栽培品种，百叶蔷薇作为蔷薇属植物的模式植物，它保留有很多蔷薇属植物共有的特性。有研究通过SSR分子标记分析发现，野生种月季与古老品种‘绿萼’和‘月月粉’亲缘关系较近，对其有一定的遗传贡献[2]； 45S rDNA FISH 定位显示，古老月季‘月月粉’和‘绿萼’都具有两个45S rDNA杂交位点，并且都是二倍体，可能具有相同起源[3]；但两品种又在花器官上有着诸多不同，例如，‘绿萼’存在着花瓣萼片化、雄蕊瓣化、香气退化等特点，其花型和花色与‘月月粉’有较大差异。因此针对这两种亲缘关系相近的古老月季和模式植物百叶蔷薇花器官的研究有着重要意义。
花器官作为植物重要的观赏器官，也是高等植物进行有性生殖的重要繁殖器官，其在高等植物的生活史中的地位不言而喻。近年来，随着PCR分子克隆和荧光定量分析等分子技术的日益成熟，花器官的发育机制得到了广泛的研究。为了了解调控花形态建成各个阶段之间的转变和顺利的发生，研究者尝试用不同的花发育模型对基因进行功能上的分类，1991年，Coen和Meyerowitz在研究拟南芥和金鱼草的花突变体时，提出了ABC模型。根据典型的双子叶植物花的结构，将四种不同器官（萼片、花瓣、雄蕊、心皮）在花顶端的分布分为四轮，该模型指出两个相邻轮的重叠遗传功能的表达，导致不同的花器官的组成。ABC模型提出后，后续对于控制花结构的基因研究大都基于此，往往将影响花器官发育的基因分为ABC三大类。当只有A功能基因被表达时，会产生萼片；当A型加B型基因被表达时，花瓣出现；B型和C型基因的共同表达则导致雄蕊形成；当只有C型基因表达时，心皮发育。除此之外，A类和C类基因存在拮抗关系。在拟南芥中A类功能基因有APETALA1(AP1)、AP2；B类功能基因包括AP3、PISTILLATA(PI)，C类功能基因有AGAMOUS(AG)。在拟南芥中，这3类5个基因中任何一个基因的功能丧失或突变都会导致花器官性状的改变。在金鱼草的ABC模型中，A类基因包括:SQUAMOSA(SQUA)，B类基因包括：DEFICIENS(DEF)、GLOBOSA(GLO)，C类基因包括:PLENA(PLE) [47]。
目前，已有实验证明，腊梅的CpAP31基因在烟草中过量表达，会引起雄蕊部分瓣化现象[8]；根据这一实验结果，有研究人员推测B功能基因可能对现代月季重瓣这一性状起到重要作用，重瓣的形成是由于雄蕊转化成花瓣造成的[9]。随着对于月季花器官的研究逐渐展开，Kentaro Kitahara等人从野生种月季中分离出MASAKO BP、euB3和B3三个B功能基因，并通过烟草和拟南芥中的异源基因表达来验证其作用，发现单独35S∷BP、35S∷euB3和35S∷B3的异源表达性状改变不明显，而35S∷BP分别35S∷B3 、35S∷euB3组合侵染会导致萼片发育转变成花瓣[10]。这一结果验证了在月季中存在着影响花发育的B功能基因，并且AP3和PI基因间存在相互作用。

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