月季（Rosa chinensis）原产于我国，是我国十大传统名花之一，也是世界四大切花之首。因其香气宜人、花色丰富、多次连续开花等特征受到人们的喜爱。因为月季一年内多次开花，故推测其对光周期不敏感。在光周期途径中，CO是感受光周期的核心因子，通过感受光信号的节律表达来调控下游FT等成花基因的表达。CO属于BBX家族，BBX家族是一类具有锌指（zinc-finger）结构的转录因子，根据其结构分为五类，是控制生长发育过程调节网络中的重要因子，其功能主要包括光周期调控成花以及植物的光形态建成。本实验探究了BBX基因家族第一类中的BBX5在月季成花中的功能。为了研究BBX5基因在月季成花中的作用，本文以月季品种“月月粉”为实验材料，根据已发表的月季基因组，对RcBBX5进行了基因克隆，构建了VIGS干扰载体并转化“月月粉”。通过表型和成花基因表达分析，推测其可能直接通过调控下游成花基因发挥功能。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keyword 3
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 材料 5
1．1．2 微生物材料 5
1．2 方法 5
1．2．1 月季“月月粉”RNA的提取 5
1．2．2 cDNA第一链的合成 6
1．2．3 引物的设计及目的基因和干扰片段的扩增 6
1．2．4 目的基因和干扰片段的纯化 6
1．2．5 构建干扰片段入门载体 7
1．2．6 干扰片段连接产物的转化 7
1．2．7 提取质粒DNA 8
1．2．8 VIGS载体的构建 9
1．2．9 转化大肠杆菌 9
1．2．10 转化农杆菌 9
1．2．11 载有干扰片段的农杆菌侵染月季 10
1．2．12 在DNA水平检测侵染月季中的干扰片段（CTAB法） 10
1．2．13 基因功能初步分析 11
1．2．14 荧光定量PCR 11
2 结果与分析 12
2．1 RcBBX5基因的克隆与分 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
析 12
2．1．2 RcBBX5入门载体的构建 12
2．1．3 RcBBX5序列分析 13
2．2 RcBBX5表达载体的构建 14
2．2．1 RcBBX5干扰片段入门载体与pTRV2的双酶切 14
2．3 VIGS转化“月月粉” 15
2．3．1 DNA水平上检测侵染月季中的干扰片段 15
2．3．2 TRVRcBBX5表型及基因表达 15
2．3．3 干扰株系中成花相关基因表达 15
3 讨论 16
致谢 17
参考文献 17
月季BBX5基因的克隆与功能验证
引言
六大成花途径中，光周期途径在植物成花途径中发挥重要作用。在光周期途径中，BBX家族基因发挥了重要的调控作用。BBX家族是一类具有锌指（zincfinger）结构的转录因子，其主要特征为N端含有1个或2个Bbox结构域，有时C端含有一个CCT（CONSTANS，COlike，TOC1）结构域。锌指转录因子是植物中相对较大的转录因子家族（约占总数的15％），并且这些因子在植物生长和发育过程中起着核心作用。锌指蛋白含有锌指结构域，可被锌等金属离子稳定，并具有与DNA，RNA或蛋白质相互作用的性质[1]。含有一个或两个预计参与蛋白质蛋白质互作的BBox基序的锌指蛋白亚组被称为BBX蛋白。BBX蛋白属于功能多样的家族。BBX蛋白是控制植物生长发育过程调节网络中的重要因子，能够介导蛋白互作和基因表达调控，参与幼苗光形态建成，光周期调控开花，避荫反应，响应生物与非生物胁迫[2]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组编码约1500个转录因子，其中40％是植物特异性的[3]，拟南芥有32个BBX家族成员，按亲缘关系，将其统一命名为AtBBX1AtBBX32。Bbox家族的CO（CONSTANS）是Putterill等（1995）通过图位克隆的方法在其中分离得到的第一个基因[4]。在植物叶片中，光周期途径主要由CO传递信号[5]，因此CO是光周期途径中调控成花的关键基因，目前已从许多植物中克隆到CO的同源基因，如大豆，小麦，水稻。在光周期调控途径中，光敏色素，隐花色素，光受体调控CO的表达，以影响CO编码的蛋白的稳定性实现[6]。CO在叶片感受光信号，在叶片维管组织中表达，激活下游FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）的表达，合成FT蛋白，运输至茎尖分生组织，行使促进开花的功能，从而调控植物成花[7]。CO/FT模式是光周期调控成花的典型模式。同时CO也受到其它基因的调控，例如FDF1，CDF1，GI等[8]。CONSTANSLIKE （COL）基因组成一个CO基因家族，根据其Bbox结构域的变化情况可分为五类，其中第一类（CO和COL1到COL5）匀含有两个Bbox结构域[9]。关于模式植物开花时间调控机制的研究进展，描绘出了植物开花时间调控网络的基本框架[10]，对于研究月季成花调控机制有借鉴意义。
连续开花是月季最重要的生物学性状之一，其使月季营养生长期缩短，此特性由原产中国的月季（Rosa chinensis）反复杂交获得。Crespel（2002）等标记的RB位点与RoSPY定位在一起，Dugo（2005）等对月季‘Blush Noisette’和光叶蔷薇96个二倍体F1杂交后代采用拟测交的策略建立了一个遗传连锁图谱，识别出两个开花时期相关的QTL，表明连续开花性状可能处于多因子控制之下。Kawamura（2011）等在一个二倍体庭院月季F1群体当中，研究了与花序开花时间和形态建成以及花朵形成相关的10个位点。月季赤霉素调控途径中的同源基因RoSPY、 RoSLEEPY和RoDELLA一起定位于花序节间伸长的位点上，花发育的同源基因RoFT和RoKSN分别定位于开花时间和RB位点上。[11]
经前期研究比对发现，RcBBX5是月季BBX家族的第一类中的一员，本研究将通过实验探究其在成花中的功能，从而对研究月季成花机制具有一定的帮助，月季具有一次开花、偶尔两次开花和连续开花等不同的开花类型，连续开花又称多次开花，是与商业价值和观赏价值直接相关联的性状。人们逐渐希望通过定向改造基因，按人为意愿控制改变开花时间以及花期。目前，国内外关于连续开花调控机制的研究还非常有限，因此此项研究是具有一定意义的。

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