甲壳类雄性性别分化主要由促雄性腺素（Androgenic gland hormone, AGH）调控。中华绒鳌蟹(Eriocheir sinenesis)是一种重要的经济甲壳类，广泛分布于我国南北各地淡水水域中。在这次实验中我们克隆获得了中华绒螯蟹的促雄性腺激素基因（EsIAG）全长cDNA序列， ES IAG基因cDNA全长为1495bp， ORF为456bp，编码151个氨基酸；并利用实时荧光定量PCR得到EsIAG在不同组织中的表达谱，EsIAG在促雄性腺及精巢中特异表达；最后通过RNA干扰技术沉默EsIAG基因，证实了EsIAG基因对河蟹的性别分化起调控作用。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 材料与方法 4
1.1 实验仪器 4
1.2 中华绒螯蟹IAG基因cDNA序列的克隆 4
1.2.1 RNA的提取 4
1.2.2 反转录 4
1.2.3 IAG基因cDNA序列克隆 4
1.2.4 RACE 产物的回收 5
1.2.5 RACE产物的连接与转化 5
1.2.6 Realtime PCR 6
1.2.7 RNA interfere 6
2 实验结果分析 6
2.1 EsIAG基因克隆 6
2.2 EsIAG序列特征分析 7
2.3 系统进化树分析 8
2.4 IAG基因的表达谱 9
2.5 RNA干扰 10
3讨论 10
致谢 11
参考文献 11
河蟹促雄性腺激素基因克隆及功能研究
引言
研究背景简介：中华绒螯蟹, 俗称大闸蟹，是我国重要的经济蟹类，养殖规模大，肉质鲜美、经济实惠，深受我国人民的喜爱，并大量出口海外，是我国重要的淡水养殖蟹类，经济效益高。目前，河蟹的养殖主要采用雌雄混养的传统模式。混养早期，由于雄性的生长速率明显高于雌性，两性之间的互相残杀造成了雌蟹的死亡率较高。到了混养后期，雌蟹的早熟导致了成蟹规格小，从而影响了整体的经济 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
效益。因此，如能实现中华绒螯蟹的单性养殖将有效地改善这种现状。
研究意义：促雄性腺素（Androgenic gland hormone，AGH）作为河蟹性别调控的重要激素，它在甲壳动物性别分化和控制中起着重要的作用，与哺乳动物类固醇性激素不同，它属于多肽类激素，说明甲壳动物性别决定机制在动物进化中处于特殊的地位。国内外学者对促雄性腺的形态结构，所分泌激素的化学性质及该激素基因克隆等开展了大量研究，特别是近几年来，随着分子生物学技术的引入，国内外关于促雄性腺的报道日益增加，如能获得蟹类促雄性腺素，注入雌性幼蟹体内得到如同虾类一样的性逆转个体。蟹类的性染色体为XY 型，性逆转后的雄性个体，其染色体为雌性——XX，如能与正常雌性个体交配，将产生全雌后代；另一方面，如果采用转基因方法转入促雄性腺素基因的话，就能够获得全雄后代，从而使中华绒螯蟹的单性养殖成为现实。
1947 年Cronin首次报道了软甲亚纲雄蓝蟹（Callinectes sapidus）具有促雄性腺（Androgenic gland，AG）[1]，直至 1954 年 CharniauxCotton才第一次阐明促雄性腺在端足类跳沟虾（Orchestia gamma rella）的功能，促雄性腺在雄性性别分化中的作用主要源于其分泌的激素—促雄腺激素[2]。随后，各国学者在其他甲壳动物中也纷纷发现了促雄性腺，相继证明该腺体几乎存在于软甲亚纲的各个目中[3] , 近年来,国内以对中国对虾和中华绒螯蟹促雄腺的结构与功能有研究报道（李富花和相建海，1996；邱高峰等，2000；）[4]。从 2007 年开始，有研究者运用 cDNA差减文库的方法在红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）中获得了在促雄性腺中特异表达的基因，该基因序列与胰岛素基因（insulin）较为类似，故此命名为类胰岛素促雄性腺因子（insulinlike AG factor）[5]。
促雄性腺早期的研究主要集中在找出具有促雄性腺的物种，并分析促雄性腺的位置形态、发生和发育、结构和功能等[6]。长期以来，由于实验手段的局限性，研究人员主要通过传统的生理学实验如促雄性腺的切除或移植，注射组织提取物等研究促雄性腺的功能，但关于促雄性腺分泌的激素（Androgenic gland hormone,AGH）的化学性质却存在着争议。近年来，随着反相高效液相色谱、气相色谱、质谱等化学分析方法的发展[7]，以及 PCR、基因克隆、重组等分子生物学方法的普遍采用，AGH 的相关报道日益增加。
近些年来，随着分子生物学技术的快速发展和实际应用应用，RNA干扰技术也用于研究促雄性腺的功能，Ventura等在雄性罗氏沼虾中利用RNAi技术降低促雄性腺特异表达的基因MrIAG的表达后，引起雄性特征的瞬时改变，精子的产生受到了抑制。在红螯螯虾中，干扰CqIAG后，雄性红螯螯虾显示出一系列雌性化特征。Ventura在最新的研究中通过对MrIAG的沉默，首次获得了性反转的罗氏沼虾，此研究为调控生物性别提供了新的视角。
AGH氨基酸序列及其部分二级结构的报道，将促进对其受体、作用方式、生物合成、分泌规律以及代谢途径等的研究，为进一步探讨甲壳动物性别决定机制提供了新的研究途径。由于AGH在结构上与胰岛素[8]相似，可借鉴胰岛素的给药方式，将其制成复盐或以高分子作为载体并加入保护剂和促吸收剂的微囊、微球或脂质体等饵料添加剂。然而，甲壳动物促雄性腺中AGH含量少，直接分离步骤繁琐，难于应用到生产实践中Okuno等成功地通过杆状病毒将AGH cDNA基因导入昆虫细胞中，并通过酶切解，得到具AGH活性的重组 AGH[9]。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/scyz/64905.html