鱼类的种类鉴定是鱼类生态学、鱼类进化学、鱼类多样性与保护研究的基础。国内准确全面的鱼类DNA条形码数据库十分有限，长江鱼类DNA条形码文库建设的滞后严重阻碍了长江鱼类早期资源的基础研究。本项目选取长江下游干流安庆、镇江、常熟三个江段，采集各江段翘嘴鲌10条、蒙古鲌10条、达氏鲌10条、拟尖头鲌10条，提取每种鱼类的DNA,通过PCR技术扩增构建下游鲌属鱼类的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome C oxidase subunit I, COI）基因长度为700bp左右的基因序列，构建长江下游鲌属鱼类DNA条形码库；同时采集长江安庆江段的鱼类早期资源，利用DNA条形码技术鉴定鲌属鱼类早期资源的种类组成，检验条形码数据库的应用效果。本研究证明了COI部分序列可以作为物种辨识的良好DNA条形码，构建的鲌属鱼类DNA条形码库可以用于鲌属鱼类物种的成功鉴定。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 样品采集3
1.2 鱼类DNA的提取4
1.3 PCR扩增目标COI基因序列5
2 结果与分析5
2.1 DNA条形码的鉴定分析5
2.2 长江中下游鲌属鱼类DNA条形码数据库的构建7
2.3 长江中下游鲌属鱼类COI条形码数据库的应用8
3 讨论8
3.1 COI基因在鲌属鱼类鉴定中的适用性 8
3.2 DNA条形码数据库鉴定鲌属鱼类早期资源应用展望 8
3.3 DNA条形码在物种鉴定方面的不足9
致谢9
参考文献9
长江中下游鲌属鱼类COI条形码基因文库的构建与应用
引言
近年来，随着PCR、DNA测序与分子杂交等技术的迅速发展，产生了DNA分类学(DNA Taxonomy)和 DNA 条形码(DNA barcoding)技术[1]。2003年Hebert[2]首次提出了以基因序列作为鉴别不同物种的条形码，即DNA条形码，被Hebert等人选中的基因为线粒体细胞色素C氧化酶I基因(COI基 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
因)的一段长度为648bP的基因片段。大量研究证明，COI基因在种内极其保守，在种上水平变异很大，能够成功地区分物种。Hebert等认为利用COI基因能从分子演化的角度，提供一种简便、可靠、快速的分类技术，即DNA条形码技术。2004年3月和5月分别成立生物条形编码秘书处(Bar code of Life Secretariat)和生物条形码协会(Consortium for the Bar code of Life，CBOL)。2004年9月， CBOL正式与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI) 结成合作伙伴，20多个研究机构参与这次会议，主要讨论是将 CBOL中的 DNA条形码序列提交给 NCBI[3]。2005年2月，由CBOL和英国自然历史博物馆主办的第一次国际会议)生命条形码协会在伦敦召开，主要讨论DNA条形码的科学进展，为1000万物种建立条形码库。同年6月，鱼类条形编码研讨会召开，这次会议主要讨论建立鱼类生命条形码网站(the Fish Barcode of Life campaign, FISHBOL) (http://www.fishbol.org)。到2010年2月28日，已记录有7250种共51309条鱼类的DNA条形码序列。Knebelsberger等分析构建了德国主要流域淡水鱼和七鳃鳗DNA条形码数据库，用于物种分类鉴定[4]。Ribeiro等建立巴西圣保罗州沿海地区135种海洋鱼类的DNA条形码数据库[5]。Zhang等利用中国南海242种鱼类COI基因鉴定其DNA条形码，开放南海鱼类数据[6]。依靠生命数据系统和更多学者的开发使用，DNA条形码数据继续完善，并已经被公认为物种鉴定的标准[7]。
鱼的mtDNA是一种带有重链和轻链的小型环状DNA分子，与哺乳动物和细菌一样。MtDNA适合进化和分子多态性研究，比核基因进化得更快，其高度保存和母系遗传。近年来利用鱼类线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因上5’端一侧的一段序列作为标准目的基因的条形码技术已经被证明是一种快速可信的方法[8]。与其他分子标记相比，比如RFLP、RAPD、基因芯片技术，DNA条形码数据库更易于构建且重复性高，更方便使用[9]。而与线粒体上其他可用作物种区分的基因序列相比，比如细胞色素氧化酶Ⅱ（Cytochrome oxidaseⅡ，COⅡ）、Cytb等，它们与COI基因的序列组成和遗传多样性具有某些相似性，但COI序列目前具有完善的通用引物并且具有较多的公布序列[10]。Keskin等利用COI条形码鉴定了89种土耳其鱼种中具有重要商业价值的淡水和海洋鱼类[11]。梁宏伟等基于COI基因序列分析比较鱼类的种内、种间遗传距离，有效鉴别鲿科不同种鱼类[12]。孙效文等研究了线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因5端651 bp的片段在128尾鲤属(Carassius)鱼类中的变异，并利用了DNA条形码进行了亚种和种的具体区分[13]。陈信忠等将DNA条形码用于在主要观赏鱼种鉴定的应用中，特别是在鲤科的大部分观赏鱼类中取得较好成效[14]。余科等证实以COI基因作为分类条形码在少鳞鳜鱼属中是可行的[15]。因此，以COI作为DNA条形码以进行鱼类物种区分具有可行性。
在长江流域已报道的淡水鱼类有361种，被称为是中国的淡水鱼类种质资源库 [16]，鲤形目鲤科鲌亚科鱼类主要有17属30种[17]，其中，主要鲌属鱼类在抑制野杂鱼类过度生长、扭转水域鱼类小型化、稳定流域内生态系统平衡、净化水质、提高饵料资源利用率等方面有着关键作用，部分属种在药用方面有较高价值[18]，不仅可以提高渔业生产的经济效益，而且还能改良水域养殖生态系统[19]，是重要的淡水中小型鱼类。但随着鲌属鱼类经济价值的增加，过度捕捞现象愈发严重，受水域生态条件变迁和水质污染的影响，天然野生鲌属鱼类呈现低龄化、小型化的趋势，种群资源显著下降[20,21]，因此，需对其进行资源保护，研究其种群变动以保证合理开发利用。鱼类早期阶段个体的形态处于动态变化的状态，同种类不同阶段个体形态变异较大，早期阶段个体形态分类特征少，易损坏等特点导致鱼类早期资源的种类鉴定工作也是鱼类生态学研究的难点之一[22]，利用DNA条形码技术鉴定物种能一定程度上避免形态学特征相似产生的鉴定误差，防止鉴定者对分类经验的过度依赖，在评价隐存种的存在和准确计算物种幼体和成体的生长周期方面，均有一定的成效。陈月华等对沙氏下鱵鱼(H. sajori)的鱼卵、幼鱼、成鱼COI基因片段的同源序列比对，发现并无变异位点，证实COI基因可用于鱼类早期资源的鉴定[23]。

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