1近几年来，在河蟹养殖的过程中，河蟹免疫力下降、性早熟等问题，如今已成为河蟹养殖业的瓶颈问题。丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine protein phosphatase, STP）是一种调节蛋白质可逆磷酸化的酶蛋白，与细胞代谢、DNA复制、信号转导等细胞活动过程相关。谷氨酸转运体(glutamate transporter, EAAT)主要维持神经元细胞外谷氨酸（Glu）的低浓度。本实验通同源克隆技术获得了中华绒螯蟹STPs和EAATs的cDNA 全长序列，EAATs的ORF长度为747bp，可编码264个氨基酸序列，预测分析其蛋白分子量和等电点分别为62.36kD和4.87。STPs的ORF长度为873b，可编码306个氨基酸序列。预测分析其蛋白分子量和等电点分别为73.59kD和4.81。进化树分析结果表明中华绒螯蟹STP基因与南美白对虾和美洲螯龙虾的同源性最高，相似度分别为88.66%和83.51%，EAAT基因与南美白对虾同源性最高，相似度为95.07%。旨在通过本实验为今后开展河蟹神经发育研究奠定理论基础。
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引言
引言
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）又称河蟹，属于甲壳纲，是重要的水产养殖经济物种之一。几乎成为了人类养殖食用，提供营养的关键物种，中华绒螯蟹养殖业也逐渐成为我国的重要支柱产业之一[1]。但是，近年来在中华绒螯蟹养殖过程中，随着集约化养殖发展，养殖面积不断增大，产量要求不断增加，养殖者投放密度过高、管理不善如投饵不当、消毒不及时、水体环境污染等问题对中华绒螯蟹的养殖造成了极大的重创，如种质退化，物种混乱，大量性早熟，各种细菌病毒疾病的发生，使中华绒螯蟹养殖业进入了瓶颈期[2]。中华绒螯蟹的生长发育离不开基因调控，近年来多项研究也是从探究中华绒螯蟹生长发育调控基因入手，来探究各类基因的表达特征和规律[35]。
丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine protein phosphatase, STP）是一种调节蛋白质可逆磷酸化的酶蛋白[6]，可逆磷酸化是真核生物细胞翻译后蛋白质活性调节的一种重要方式，分别由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化，磷酸化的蛋白需要及时地去除磷酸基团以保障细胞生命活动的正常进行。近年来更详细阐述STP家族的 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
结构，研究表明[7]其可分为两大家族：PP1家族蛋白，其可催化磷酸化酶激酶的β亚基；PP2家族蛋白可使磷酸化酶激酶的α亚基去磷酸化。PP2家族又可分为3个亚家族：PP2A、PP2B和PP2C。姚利晓等实验证明STPs活性的最适pH值为8.0，最适反应温度为60℃。Mn2+、Ni2+可促进STPs的活性,Ca2+是PP2B家族蛋白发挥酶活性的激活剂，而Mg2+是PP2C家族蛋白的激活剂[8]。在寄生虫相关实验中发现PP1主要分布于雄虫生殖组织，包括精巢、贮精囊和输精管，在雄性生殖细胞中分布较多。研究表明PP1在雄虫中可能参与精子生成等生殖生理过程[910]。在一些植物生长发育研究中发现，STP与细胞的早期发育、细胞分裂以及植物的耐盐性相关[11]。因此，STP与细胞代谢、DNA复制、基因转录、RNA剪接、信号转导等细胞活动过程相关。
谷氨酸转运体(glutamate transporter, EAAT）主要维持神经元细胞外谷氨酸（Glu）的低浓度，EAAT的缺失会导致Glu的摄取及转运发生障碍，引起Glu的堆积，而突触间隙中Glu的大量堆积会导致神经元的毒性作用[12]。目前已经发现的兴奋性氨基酸转运体共有5种，EAAT1EAAT5[13]。EAATs较多研究是在小鼠上开展的，研究表明[14]EAAT在高氧中转运Glu的能力降低，且随着氧气浓度的增加，谷氨酸转运体转运 Glu 的能力越低，脑损伤则越严重。Matsumoto[30]等报道在脑缺氧缺血性疾病中，GLT1的功能受到抑制，可引起中枢神经系统 L谷氨酸的过量释放，并加重神经元的损伤，从而导致神经元死亡。研究还发现它与人类癫痫、 神经系统疾病的发生相关[14]。在家蚕和果蝇等昆虫类的研究中发现EAAT1 蛋白选择性地分布于神经突触周围的神经胶质细胞，EA AT2 在头部和精巢中都有较高量的表达，并且EAAT1 基因失活还会导致果蝇寿命缩短，脑神经显著退化。这表明果蝇 EAAT蛋白在中枢神经系统发挥着重要作用。因此，EAAT在维持正常的胞外谷氨酸浓度以及中枢神经系统的生理活动如认知、记忆、学习、发育可塑性等方面发挥着重要作用[15]。本研究的开展旨在为今后进一步开展中华绒螯蟹神经发育相关研究奠定理论基础，为今后更好地指导河蟹养殖业的发展提供理论参考。
因为在中华绒螯蟹基因克隆的研究中，多数是与蜕皮相关的基因，很少有其神经传导相关基因联系，但是STP和EAAT基因与细胞生长代谢、细胞周期、信号传导和神经系统以及个体的生长发育有密切的联系，与中华绒螯蟹生长过程中个体发育不良等问题有相关性，因而本课题采用同源克隆法开展了中华绒螯蟹神经信号传导调控基因丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine protein phosphatase, STP）和谷氨酸转运体(glutamate transporter, EAAT)两个基因进行克隆、测序，并对其高级结构进行分析，而后通过氨基酸序列比对和构建其系统进化树，最终揭示其系统进化关系，旨在通过本实验为今后开展中华绒螯蟹神经发育研究奠定理论基础[16]。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（购自阳澄湖）、液氮、TaKaRa RNAiso plus试剂、核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳检测仪、PrimeScript One Step Enzyme Mix(TaKaRa)试剂
1.2中华绒螯蟹STP和EAAT全长序列的克隆
1.2.1总RNA的获取
取肝组织于液氮中研磨，使用TaKaRa RNAiso plus试剂，按照试剂盒说明书提取总RNA，核酸蛋白测定仪与1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性。
1.2.2采用RTPCR方法合成cDNA
使用PrimeScript One Step Enzyme Mix(TaKaRa)进行扩增, 取中华绒螯蟹肝胰脏组织提取的总RNA为模板，按照NCBI报道的相关物种保守序列使用Prime Premier 5软件设计正反引物（表1），使用PrimeScript One Step Enzyme Mix(TaKaRa)进行反转录以获得相关基因的的ORF区cDNA序列。PCR扩增体系为：cDNA模板2.5μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，上下游引物(20µmol/L)各0.25μL，10×PCR bufferⅡ2.5μL，TAKARA Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加无菌去离子水至总体积25μL[17]。设置的PCR反应条件为：94℃变性30sec, 55以及65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测之后4℃保存。将样品送至碧云天生物技术公司进行测序。将测序所得序列与NCBI已报道物种的EAATs和STPs基因序列进行比对，确定是否为中华绒螯蟹EAAT和STP基因[18]。

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