为了系统研究Adcyap1基因对刀鲚(Coilia nasus)和斑马鱼（Danio rerio）的生长调控作用，利用NCBI和基因组数据库，获得斑马鱼Adcyap1基因的cDNA全长；通过BLAST比对，获得了刀鲚Adcyap1基因的cDNA全长。运用相关软件分析了刀鲚和斑马鱼Adcyap1基因氨基酸序列，结构特征。二级结构预测显示，刀鲚和斑马鱼Adcyap1具有Adcyap1家族的典型结构域。氨基酸多重对比显示刀鲚和斑马鱼序列相似度高达78%，同时进化树分析表明刀鲚与斑马鱼相近度非常高。刀鲚Adcyap1基因与生长的关联分析表明，刀鲚Adcyap1基因与刀鲚生长呈显著相关。斑马鱼Adcyap1基因的敲除实验表明斑马鱼Adcyap1基因的缺失造成斑马鱼在体重、体高、体宽、全长、体长方面较正常野生型生长缓慢。本研究分析了刀鲚和斑马鱼Adcyap1基因的结构特点，对Adcyap1基因在刀鲚和斑马鱼中的生长调控作用做了关联分析和敲除实验。为后续揭示鱼类生长机理，开发新鱼种提供前期基础资料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验鱼 2
1.1.2 试剂和试剂盒 2
1.1.3 实验器材 2
1.2 方法 3
1.2.1 斑马鱼DNA的提取 3
1.2.2 DNA的检测 3
1.2.3 阳性检测 3
1.2.3.1 引物设计 4
1.2.3.2 PCR扩增 4
1.2.3.3 测序 4
1.2.4 核酸及氨基酸序列分析 4
2 结果与分析 5
2.1 Adcyap1基因序列及分析 5
2.2 Adcyap1基因同源性分析与进化树分析 8
2.3 刀鲚Adcyap1基因与生长的关联分析 9
2.4 斑马鱼Adcyap1基因的敲除 10
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 12
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1基因在刀鲚和斑马鱼中的生长调控作用
引言
随着生物学基础研究的深入，基因功能的探索已成为生命科学研究的重要课题之一。它不仅对理解生物发展现象具有重要的理论意义，而且影响生产实践的应用。本课题的研究对象之一刀鲚（Coilia nasus）隶属于鲱形目（Clupeiformes） 、科鳀 （Engraulidae）、鲚属（Coilia），俗称刀鱼、毛花鱼, 其肉质细嫩, 味道鲜美, 是长江中下游重要的洄游性经济鱼类[1]。但由于多年来的持续高强度捕捞, 加上环境污染、水质恶化等原因, 刀鲚产量持续下降[24]。虽然刀鲚可以被人工养殖，但养殖刀鲚两周年才能达到商品规格(体质量 125 g 以上), 生长速度有待进一步的提高[3]。因此，本实验以刀鲚和模式生物斑马鱼（Danio rerio）为研究对象，探讨Adcyap1基因在刀鲚和斑马鱼中的生长调控作用，为后续鱼类生长相关育种靶基因的发掘提供研究基础。
目前，对刀鲚的生物学特征、遗传多样性、资源状况、洄游与定居型刀鲚的差异、刀鲚的人工养殖等方面有很多的学者在研究[4]，并且进展颇丰。在张呈祥，陈平[5]，徐钢春[78]等众多科技工作者的努力下，突破了灌江纳苗养殖、池塘扩繁、人工繁殖及苗种培育技术，成功实现了刀鲚的人工养殖。但是，在基因调控刀鲚生长方面的研究较少。杜富宽等[9]研究发现了刀鲚 MSTN 基因的序列和功能具有高度保守性，为刀鲚后续育种提供了基础。王晓梅，朱国利和唐文乔[10]做了长江刀鲚 mor4k13 基因的分离鉴定和表达分析，发现mor4k13 基因与嗅觉功能和性腺发育相关。目前，没有发现Adcyap1基因调控刀鲚生长这方面的研究。
本课题的另一研究对象斑马鱼，由于斑马鱼具有体外受精、体外发育及胚胎透明等优势，所以非常适合开展基因编辑操作,方便构建突变体和转基因种系[11]。目前比较简易高效的模式生物基因编辑技术是CRISPR/Cas9基因编辑技术,其可以在目的基因片段上选择g RNA(guide RNA)靶位点，Cas9 m RNA在gRNA的引导下，可实现对基因组特定位点的剪切，利用DNA自我修复时可能发生序列错配，引入插入缺失(indel)突变，导致基因阅读框的改变，实现基因敲除的作用[1314]。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼的某个特定基因，从而研究该基因对斑马鱼组织发育的影响，类似的研究有很多。例如，但弘[15]研究了fus 在斑马鱼生长发育中的功能,对fus 进行了序列分析、时空表达分析和基因敲除，发现fus 对斑马鱼体型生长以及在成鱼中两性生长异形起着调控作用，fus突变造成与生长相关的一些基因表达失调。张玮[12]做了斑马鱼adcyap1b基因的敲降对脑室发育影响的初步研究，发现在斑马鱼早期抑制adcyap1b基因表达会导致后脑部过度扩张，影响脑脊液正常流动和引起PKA信号通路中CREB的磷酸化降低。钱亭，陈向军，邓波等[17]学者利用CRISPR/Cas9技术敲除dync1h1基因后，发现该基因显著影响斑马鱼神经系统发育。以斑马鱼作为模式生物展开对基因功能的研究还有很多，其中最常用的基因编辑技术是CRISPR/Cas9基因编辑技术，该技术在探究小鼠和其它生物基因功能的研究上也多有运用。本课题就要利用CRISPR/Cas9技术敲除Adcyap1基因来研究其在斑马鱼生长调控中的作用。
目前，关于Adcyap1基因在鱼类生长发育中起怎样的调控作用？还有哪些基因调控着鱼类的生长发育？这些问题还不清楚。本研究选择Adcyap1基因在刀鲚和斑马鱼中的生长调控作用，可用于后续揭示鱼类生长机理，找出控制鱼类生长的全部基因做准备，为开发新鱼种提供依据，为其他动物的生长研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验鱼
刀鲚取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地，室内水泥池驯养，共取60尾。斑马鱼取自大学无锡渔业学院，采用斑马鱼循环水系统养殖，每天早、中、晚三次投喂丰年虫。

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