[目的]克隆不同生长阶段的团头鲂Sirtuin1基因编码阅读框（ORF），并分析其在团头鲂不同生长阶段、不同组织当中的表达分布情况，为未来的研究提供基础数据。[方法]采集18条不同生长阶段的团头鲂，取鳃、脑、肌肉、肝脏、脾脏、肾、头肾、心、肠等9种组织并提取总RNA，采用实施荧光定量PCR技术，扩增和克隆团头鲂Sirt1基因并对其不同生长阶段中不同组织表达进行分析[结果]团头鲂Sirt1基因ORF由2070个核苷酸构成，编码689个氨基酸。根据团头鲂Sirt1 ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对时，发现其与与安水金线鲃Sinocyclocheilus anshuiensis、鲤鱼Cyprinus carpio,、斑马鱼Danio rerio,、犀角金线鲅Sinocyclocheilus rhinocerous、滇池金线鲃Sinocyclocheilus grahami 、美丽硬仆骨舌鱼Scleropages formosus、非洲鲫鱼Oreochromis niloticus的同源性分别为80%，78%，74%，79%，78%，68%，64%。Sirt1基因在健康的团头鲂各生长阶段，鳃、脑、肌肉、肝脏、脾脏、肾、头肾、心、肠等9种正常组织中都有表达，Stage1中，较高程度表达于肾，中等程度表达于头肾、心、脑、肌肉，较低程度表达于鳃、肠、脾、肝脏；Stage2中，较高程度表达于肾、头肾、心、脑、肌肉、肝脏，中等程度表达于脾，较低程度表达于鳃、肠；Stage3中，较高程度表达于脑，中等程度表达于肾、脾、肌肉、肝脏，较低程度表达于鳃、头肾、肠；Stage4中，较高程度表达于肾，中等程度表达头肾、脾、脑、肌肉、肝脏，较低程度表达于鳃、心、肠；Stage5中，较高程度表达于肾、脾、脑、肌肉、肝脏，中等程度表达于头肾，较低程度表达于鳃、心、肠；Stage6中，较高程度表达于肾、脾、脑、肌肉、肝脏，中等程度表达于头肾、肠，较低程度表达于鳃、心。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1.1试验动物以及样品的制备5
1.2 Sirt1 cDNA的克隆6
1.3 核苷酸序列和生物 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
信息学分析6
1.4 不同生长阶段以及组织中Sirt1表达的实时定量PCR分析6
1.5 数据分析6
2结果与分析6
2.1团头鲂SIRT 1的分子克隆和结构分析7
2.2团头鲂SIRT 1与其他物种的比较7
2.3团头鲂SIRT 1蛋白的结构8
2.4团头鲂SIRT 1于各生长阶段各组织中的mRNA相对表达水平8
3讨论9
3.1团头鲂SIRT1基因的系统进化关系9
3.2团头鲂SIRT 1于各生长阶段各组织中的mRNA相对表达水平10
致谢11
参考文献11
团头鲂Sirtuin1基因克隆及组织表达分析
引言
Sir2(酵母沉默信号调节因子2，silencing information regulator 2))相关酶类,是一种高度保守且依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NAD+)的蛋白去乙酰化酶类。Sir2在代谢调节、细胞寿命、基因沉默及基因组稳定性的调节上具有不可或缺的作用。Ivy等首先从酵母中分离并鉴定出Sir2基因[1]。随后研究者们相继在研究线虫和果蝇的过程中发现Sir2参与细胞寿命的调节过程[2]。21世纪初，人们从哺乳动物上发现并鉴定出与Sir2同源的一个蛋白质家族,统称为 Sirtuin(SIRT)[3]，哺乳动物Sirtuins家族共有7名成员。相对Sir2而言，Sirtuin进化得较为保守, 但是在其结构以及功能上皆与 Sir2 保持着较高的同源性,其中SIRT1与酵母菌Sir2同源性最高[4]。SIRT1 与多种信号传导通路中的头蛋白盒转录因子相互作用,参与神经保护,细胞衰老凋亡、糖脂类代谢、炎症氧化应激反应等过程， 发挥其对基因的调控功能。SIRT1的上述功能，引起各学科研究人员的广泛关注。
团头鲂(Megalobrama amblycephala), 俗称武昌鱼, 隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲌亚科(Culterinae)、鲂属(Megalobrama)。团头鲂原产于长江中游的长江湖泊中, 如梁子湖、淤泥湖和鄱阳湖等。由于其生长快、易捕捞、环境适应能力强、人工繁育要求不高、抗病性强, 已经成为我国重要的养殖经济鱼类。目前国内外对团头鲂SIRT功能虽有一定的了解，但其具体生理生化功能及机制有待进一步更深入研究。本实验将为其后续研究提供一定的数据基础。
在鱼类中，随着放射免疫方法的改进，鱼类胰岛素水平被证实接近甚至略高于哺乳动物，而且鱼类存在胰岛素受体，摄入糖类后胰岛素水平和受体均能适应性上调[5]。因此，鱼类对糖的代谢特点被认为与人类非胰岛素依赖的II型糖尿病相似，摄入过量糖类会出现血糖持续偏高等胰岛素抵抗现象，与体内糖代谢酶活性的调控因子紧密相关[6]。目前，关于Sirtuin蛋白家族成员参与动物机体糖脂代谢的调控研究，较多关注SIRT1，包括肝脏、肌肉、脂肪、胰岛和脑中非常精细和复杂的对糖脂脂代谢调控作用。SIRT1可以去乙酰化组蛋白，还可以去乙酰化很多重要的转录因子和调节蛋白，从而调控多种生物学过程。近来的研究显示，SIRT1广泛地参与了肝脏中的糖脂代谢。在短期饥饿时，SIRT1可以抑制糖异生关键因子TORC2，从而抑制糖异生，降低血糖浓度[7]。而在长期饥饿的条件下，SIRT1去乙酰化并激活PGC1α和PPARα，促进脂肪酸的氧化并改善葡萄糖稳态[8][9]。在长期饥饿状态下，SIRT1还通过去乙酰化FOXO1、STAT3等促进糖异生并抑制糖酵解[10][11]。此外，SIRT1还可以通过去乙酰化CREB，从而调节糖脂代谢[12]。
1 材料与方法
1．1 试验动物以及样品的制备
试验用团头鲂由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地提供，从其中选取鱼体健康，体表无伤痕，形态正常、无畸形，游动能力强的个体于室内循环水玻璃纤维养殖桶（容积300L）中饲养，试验过程中，日夜连续充气增氧，并观察鱼体活动是否正常，以便及时采取相应的措施。整个试验期间水质如下：平均水温（26.0±1.5）℃，溶氧≥ 6mg/L，氨氮≤0.2 mg/L，亚硝酸盐≤0.02 mg/L，pH为6.87.0。
最后选取不同生长阶段（表1）共计18条，取鳃、脑、肌肉、肝脏、脾脏、肾、头肾、心、肠等9种组织（表2）并快速置于80℃冰箱备用。
表1 试验用团头鲂各生长阶段对应体重范围
Table 1 The body weight range of each stage of growth
生长阶段
体重范围
Stage 1
<10g
Stage 2
1050g
Stage 3
50100g
Stage 4
100200g
Stage 5
200300g
Stage 6
300400g

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