本研究在获得克氏原螯虾发病组织样本高通量测序若干片段的基础上，分别设计了内引物和外引物进行巢式RT-PCR,在健康虾的肝胰腺中鉴定出一株新的病毒，暂将其命名为pcpv3(Procambarus clarkii picornavirus Ⅲ)。利用分子克隆和桑格测序技术对空缺片段进行扩增和测序，并将测序结果进行拼接，获得了长度为3842nt的其部分全长序列。进一步通过生物信息学工具对该病毒的基因序列进行了遗传进化分析，结果表明该病毒与双顺反子病毒科的蟋蟀痹病毒（Cricket paralysis virus，CrPV）较为接近，二者在进化保守非结构蛋白RNA依赖型RNA聚合酶上的氨基酸同源相似性为94%，初步判断该病毒在分类上属于小RNA病毒目的双顺反子病毒科。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1样本采集 2
1.2总RNA提取 2
1.3巢式RTPCR检测病毒3
1.3.1反转录PCR3
1.3.2外引物和内引物设计3
1.3.3巢式PCR3
1.4空缺片段的分子克隆和测序3
1.4.1巢式PCR扩增空缺片段3
1.4.2克隆和测序4
1.5序列拼接和分析 4
2结果与分析5
2.1病毒检测结果 5
2.2病毒序列测序结果 5
2.3病毒序列分析 5
2.3.1非结构蛋白区域氨基酸序列5
2.3.2遗传进化聚类分析5
3讨论6
3.1淡水鳌虾小RNA病毒病研究历史6
3.2 pcpv3潜在的致病性探讨6
3.3研究总结和展望7
致谢7
参考文献8
图1 10
图2 10
图3 11
图4 11
图5 12
表1 13
表2 13克氏原螯虾小RNA样病毒的鉴定及其基因组序列分析
引言
引 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
言：克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又名美国螯虾、路易斯安那州螯虾，我国大陆地区称小龙虾。在动物分类学上，克氏原螯虾是隶属于节肢动物门( Arthropoda)甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）刺蛄科（Astacidae）原螯虾属（Procambarus）的淡水鳌虾类[1]。克氏原螯虾原产地为美国南部和墨西哥东北部，20世纪20年代传入日本，1929 年由日本引入我国， 半个多世纪以来，其自然种群发展很快，已广泛分布于我国大部分省市，特别是在长江中下游地区已成为优势种群[2]104。又因其具有高蛋白、低脂肪，营养成分丰富且风味鲜美等诸多优良特点，越来越受到消费者的青睐，近年来已逐渐成为水产养殖业中的重要品种。伴随着克氏原螯虾人工养殖业的发展，出现了稻田养殖、大棚养殖、工厂化养殖等高效养殖模式，促进了克氏原螯虾的养殖产量和规模的迅速增长。然而病害的时有发生严重制约了克氏原螯虾养殖产业的进一步发展，其中，病毒病又是对克氏原螯虾养殖造成的主要威胁之一。近年来，我国克氏原螯虾主产区不断有白斑综合征病害爆发的报道[35]，给养殖户造成巨大的经济损失。
尽管目前对于克氏原螯虾养殖过程中最常见的白斑综合征和白斑综合征病毒( white spot syndrome virus,WSSV)的检测、鉴定及其基因组序列分析已经有比较深入的研究和报道[68]，但是总体来说，有关克氏原螯虾螯虾病毒性疾病尤其是RNA病毒性疾病领域已取得的研究进展和积累的相关背景知识和经验还是非常有限的, 对克氏原螯虾病毒性疾病的实验研究也还只是最近十来年才逐渐展开的，许多病害的病原体和作用机制仍然是模糊不清的[9]。已有一些研究结果证明,克氏原螯虾体内病毒一般处于潜伏感染状态, 其体内存在的多种病毒即使在寄主中出现, 其症状也并不明显 ,甚至没有组织学方面的病变迹象。然而 ,一旦温度、水质等水体环境急剧变化或适宜病毒繁殖, 寄主暴发性死亡的可能性就会大大增加[9, 10]，因此，对于克氏原螯虾体内潜在的致病性病毒的研究是十分重要的。
小RNA病毒目(Picornavirales)是一类直径约30纳米的无囊膜二十面体对称的单链或双链正链RNA颗粒病毒，该病毒超家族中已归类的病毒主要包含有五个科（family）：小RNA病毒科（Picornaviridae），双顺反子病毒科（Dicistroviridae），Iflaviridae科, Secoviridae科，Marnaviridae科。遗传物质除Secoviridae科病毒由两条5800到8400nt和3200到7300nts长的双链RNA组成外，其余病毒多为长度在700012500nt之间的单链正义链RNA。其中，小RNA病毒科的病毒主要感染脊椎动物，Secoviridae科的病毒主要感染植物，双顺反子科病毒和Iflaviridae科的病毒主要感染无脊椎动物，而Marnaviridae科病毒主要感染藻类[11, 12]。
本研究在获得了克氏原螯虾发病组织样本的高通量测序片段的基础上，设计特异性引物，利用巢式RTPCR技术对小RNA样病毒进行鉴定，并通过分子克隆补齐测序片段，利用生物信息学的手段对所得序列进行分类和分析，以探讨该病毒分类学地位并尝试推测其潜在的致病性，从而为生产实践中的虾蟹病害预防、鉴定和诊断提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1．1 样本采集
本实验所用的克氏原螯虾均购自无锡市滨湖区雪浪街道农贸市场，分批随机购买30只不同规格和来源的虾。依次取肝脏样本约0.05g于RNaseFree离心管中，剩余组织用密封袋进行密封并编号，置于80℃冰箱中备用，每次检测十个样本。
1．2 总RNA提取
根据试剂生产商提供的说明书，在冰盒上进行以下操作步骤。向装有新鲜肝脏的离心管中立即加入1mL RNAiso Plus(购自北京康为世纪生物科技有限公司)和两粒经高温高压灭菌的石英小磁珠，匀浆机设置60Hz旋涡振荡200s，室温静置5min，随后置于冷冻离心机中，温度和转速分别设置为4摄氏度、12000r/min离心5min，取上清液600μL于新的RNaseFree离心管中，加200μL氯仿剧烈上下摇晃15s后室温静置5min，随后置于冷冻离心机中，温度和转速分别设置为4摄氏度、12000r/min离心15min，取上清液水相200μL于一新的RNaseFree离心管中，加500μL的异丙醇与之充分混匀，室温静置10min，置于冷冻离心机中4℃12000r/min冷冻离心10min，用移液枪吸除上清液，并用体积分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次，用移液枪吸除乙醇洗涤液，随后置于预先灭菌的超净工作台中鼓风干燥，去除管中残留乙醇液体保留RNA颗粒，加入30μL DEPC水溶解提取的RNA颗粒。通过核酸定量仪测定OD260nm/OD280nm,确保OD值为1.82.0，RNA浓度约为500ng/μL,用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及完整性。

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