ATG5（autophagy-related gene 5）基因是一个重要的自噬相关基因，其编码的蛋白是自噬体的主要组成部分，能够介导自噬与凋亡等多种重要的细胞生物学过程的发生。前期研究发现ATG5在猪卵泡闭锁过程中差异表达。为了进一步了解猪ATG5基因特征和在猪卵泡闭锁中的作用，本试验拟以猪ATG5基因为研究对象，通过扩增克隆技术获得不同猪种ATG5基因编码区序列，并对其序列特征进行分析；通过构建猪ATG5基因的真核生物表达载体pcDNA3.1-ATG5和设计合成猪ATG5基因特异性小干扰RNA即ATG5-siRNA，过表达或干扰猪卵巢颗粒细胞中ATG5；利用流式细胞技术（FACS）与qRT-PCR技术分别检测ATG5基因过表达或干扰后猪卵巢颗粒细胞的凋亡率以及凋亡标志基因的表达水平。结果表明猪ATG5基因编码区序列长度为828bp，编码蛋白含有275个氨基酸残基；不同猪种（长白猪、大白猪、苏淮猪、梅山猪、二花脸猪以及五指山猪）ATG5基因编码区序列一致性为100%，未发现多态位点，且哺乳动物ATG5基因也高度保守。qRT-PCR和Western Blot显示，构建的过表达载体pcDNA3.1-ATG5在猪卵巢颗粒细胞中高效表达，而合成的ATG5-siRNA可有效敲低猪卵巢颗粒细胞中内源性ATG5水平。FACS结果表明过表达ATG5基因能够显著上调猪卵巢颗粒细胞调亡率，下调BCL2/BAX比值；而敲减ATG5基因则出现相反的结果。综上所述，猪ATG5基因是一个高度保守基因，可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 试验动物 3
1.2 颗粒细胞体外培养与转染 3
1.3 基因组DNA与细胞总RNA提取 3
1.4 PCR扩增、测序与SNP位点筛选 3
1.5 生物学信息分析 4
1.6 猪ATG5基因过表达载体的构建及干扰RNA的设计 4
1.7 qRTPCR 4
1.8 Western Blot 5
1.9 细胞凋亡检测 5
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1.10 数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 猪ATG5基因编码区PCR扩增 5
2.2 猪ATG5基因编码区序列特征分析 6
2.3 猪ATG5蛋白氨基酸序列与编码蛋白特征分析 7
2.4 猪ATG5基因过表达效果检测及其对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响 8
2.5 猪ATG5基因干扰效果检测及其对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
ATG5基因的克隆及其在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用
引言
作为一种普遍存在于雌性哺乳动物卵巢组织中的生理过程，卵泡闭锁（follicular atresia）能够显著影响卵泡的发育、成熟与排卵过程。前人研究指出雌性哺乳动物卵泡发育过程中仅有极少数量的卵泡（少于1%）能够发育成熟并最终排卵，闭锁与退化是绝大多数卵泡的最终命运，而这是对生物资源的一种巨大浪费，同时卵泡闭锁也会严重影响雌性哺乳动物的繁殖力[1]。通过对雌性哺乳动物卵泡发育过程分析指出，引起卵泡闭锁的主要诱因是卵巢颗粒细胞（Granulosa cell, GC）的凋亡[2, 3]。研究发现哺乳动物卵巢颗粒细胞凋亡过程受到一个由多分子、多因素组成的精密复杂网络的调控，其中主要参与调控细胞凋亡的因子包括表观遗传学因子(DNMT家族、miRNAs以及lncRNAs)、类固醇激素(FSH、GnRH、GH、雄激素、雌激素)、细胞因子(EGF、TGFα、IGFI、TNFα、IL1β)和自噬（autophagy）相关因子等[4]。自噬过程是将细胞溶质和其特定内容物递送至溶酶体以进行降解的细胞内分解代谢过程[5]，其对卵巢颗粒细胞凋亡的影响具有两面性，一方面自噬可促进颗粒细胞凋亡，另一方面自噬可抑制细胞凋亡的能力[6,7]。目前已有研究证实在哺乳动物多种细胞中，自噬相关基因（Beclin1与ATG5等）编码的自噬相关蛋白能够与多个凋亡相关蛋白（BCL2、P53家族）互作，参与调控细胞自噬和凋亡过程的发生[8]。因此，自噬相关基因正迅速成为卵巢颗粒细胞凋亡研究领域的新热点。
ATG5基因（autophagyrelated gene 5）是重要的自噬相关基因之一，其编码蛋白是细胞内自噬体形成的关键组成部分。研究发现，以ATG5蛋白为核心的ATG12ATG5ATG16L复合物系统的形成能够促进胞内自噬小泡的伸展与扩张，进而促进了环状自噬体的形成，最终介导细胞自噬过程的发生[9,10]。另外，研究还指出ATG5蛋白不仅能够促进自噬体的形成，同时还能够诱导细胞凋亡过程的发生，因此，ATG5基因也被认为是调控细胞自噬和细胞凋亡的分子开关[11]。例如，阿霉素通过钙蛋白酶介导的ATG5切割将大量消耗S1P磷酸水解酶1（SPP1），随后细胞中的保护型自噬转换为凋亡型自噬，ATG5蛋白的高水平表达与活化将会诱导细胞凋亡形态的出现, 从而导致细胞发生凋亡，但潜在的分子机制尚不清楚[12]。生物学领域中针对ATG5基因的研究从未停止过，但是目前对该基因的研究（表达调控与功能）多见于人、小鼠、家兔、水牛及家蚕等动物中[13,14]。目前关于猪ATG5基因研究较少，其基因序列和多态性的研究均未见报道。同时，ATG5基因在猪卵泡发育等功能的研究还是空白，其在猪卵巢颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁过程中发挥的作用尚不清楚。因此，本试验拟以猪ATG5基因为研究对象，通过扩增克隆获得猪ATG5基因编码区序列，并进行序列特征分析；通过构建猪ATG5基因的真核生物表达载体pcDNA3.1ATG5和设计合成猪ATG5基因特异性小干扰RNA即ATG5siRNA，过表达或干扰猪卵巢颗粒细胞中ATG5；利用流式细胞技术（FACS）与qRTPCR技术分别检测ATG5基因过表达或干扰后猪卵巢颗粒细胞的凋亡率以及凋亡标志基因的表达水平，以期为完善猪卵泡闭锁的分子机制，提高母猪繁殖力提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
本试验中随机选取健康无病、体况良好的成年母猪（长白猪、大白猪、苏淮猪、梅山猪、二花脸猪和五指山猪），采集耳组织样，20℃冻存，用于提取基因组DNA。选取健康的杜长大三元杂交母猪，经屠宰后立即取出卵巢组织，部分置于37℃生理盐水中，用于卵巢颗粒细胞体外培养；部分置于液氮中冻存，用于提取卵巢组织总RNA提取。
1.2 颗粒细胞体外培养与转染
新鲜屠宰的卵巢2 h之内运回实验室，使用PBS洗去血液。选取直径为35mm的卵泡，使用一次性注射器插入有腔卵泡中吸取卵泡液，1000 rpm离心5 min收集细胞，PBS洗涤细胞，弃上清，重复三次。使用DMEM/F12培养基（10%FBS+1%PS）重悬细胞，苔盼蓝染色和血球计数板检测活细胞数目，调整颗粒细胞密度后置于37℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养，每24 h换液一次。48 h后贴壁细胞可以进行转染与相应处理。本试验利用Lipofectamine 3000转染试剂（ThermoFisher）在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中分别转染pcDNA3.1ATG5及ATG5siRNAs。

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