1.前言几丁质(N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物)是病原真菌细胞壁的主要成分,几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质,使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质的沉积,致使病原体死亡,且所产生的细胞壁碎片具有诱导作用,可激发寄主植物的抗病反应[1].植物几丁质酶具有广泛的生理活性[2],尤其在 更多精彩就在： 51免费论文网|www.jxszl.com 
植物抗病方面具有重要作用[3].探究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶基因的表达具有组织特异性,参与了植物的发育调控.如几丁质酶参与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程.几丁质参与共生作用：几丁质酶可以降解固氮菌的结瘤因子,Minic等探究苜蓿中的几丁质酶对某些结瘤因子具有降解作用.所以几丁质酶通过控制结瘤因子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡,而不产生过量的根瘤.此外,几丁质酶对结瘤因子的降解具有专化性,可能是决定根瘤菌的寄主专化性的因素之一[5].本探究旨在通过构建几丁质酶表达载体制备几丁质酶,用于抗真菌等方面的相关探究.2.材料与方法2.1.实验材料人参由吉林农业大学基因工程实验室培育.大肠杆菌菌株为DH5-α,原核表达载体pET-28a(+).BL21均是由吉林农业本科生命科学基因工程实验室保存.质粒小提试剂盒.ExTaq酶.solutionI连接酶.限制性内切酶.分子量标准DL-2,000购自大连宝生物公司.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等均购自北京鼎国生物公司.植物基因组DNA小量提取试剂盒.DNA切胶回收试剂盒及清洁试剂为美国Axygene公司产品.引物和测序均由上海生工公司完成.2.2.实验方法2.2.1.人参Gchi1基因扩增按GenBank中人参GchiI基因序列(GeneID:DQ532359)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点设计特异引物,并在引物两端分别加酶切位点.上游引物序列为5'CAATTAggATCCATggCATCTCATTTgTCg3’,含有XhoⅠ酶切位点(下划线).下游引物序列为5'CTATATCTCgAgTCACACATCgCTCTTgAT3’含有BamHⅠ酶切位点(下划线).采用上述引物进行PCR扩增反应,以人参cDNA为模板,反应程序如下：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒,62℃退火30秒,72℃延伸30秒,35个循环；反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测.2.2.2人参Gchi1基因原核表达载体的构建将纯化后的PCR产物用XhoI及BamHI进行双酶切,同时对pET-28a(+)质粒进行双酶切,然后进行去磷酸化处理,构建重组载体pET-28a(+)-Gchi1.将此重组载体转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆并进行PCR及酶切鉴定,将鉴定后质粒送至上海生工公司完成测序鉴定.2.2.3.目的蛋白的诱导表达及检测将含有表达载体pET-28a(+)-GchiI的大肠杆菌振荡培养至OD600=0.6时,加入终浓度分别为0.4.0.6.0.8和1.0mM/L的IPTG.30℃,200rpm/min振荡培养,诱导表达5h后,离心收集菌体,菌体以含0.2mg/ml溶菌酶和10mMDTT的磷酸钠缓冲液(20mM,pH7.2)悬浮,反复冻融4次,以超声波破碎后的样品离心,收集上清液进行PAGE检测.2.2.4.目的蛋白活性鉴定目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定,将锈腐菌接种到PDA培养基,使其在25℃下生长1周左右.用直径1cm沾有上清液的滤纸放到菌丝边缘,以沾有无菌水的滤纸为对照,一周之后观察生长情况.以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大小确定菌株是否诱导表达几丁质酶,以及所产几丁质酶的活性.3.结果3.1.人参Gchi1基因扩增及重组表达载体pET-28a(+)GchiI的鉴定经PCR扩增的Gchi1基因片段经过1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果图1A显示能够扩增出897bp大小的特异核酸片段与预期相符.将构建的重组载体进行酶切鉴定后,能够获得约897bp的大小的条带与预期结果相一致,结果见图1B.将菌落PCR及双酶切检测均呈阳性的pET-28a(+)GchiI质粒进行测序,测序结果表明pET-28a(+)GchiI重组载体构建正确,且具有正确的读码框.图1Gchi1基因的扩增产物及载体鉴定A：Gchi1基因PCR产物凝胶电泳M1：DL2000Marker,1.阳性扩增产物2.阴性对照B：pET-28a(+)GchiI质粒双酶切鉴定M2：DL2000Marker,3.BamHI和XhoⅠ双酶切鉴定4.pET-28a(+)GchiI重组质粒3.2.目的蛋白的诱导表达及检测在E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导,相对于未诱导菌株对照,经SDS-PAGE剖析表明pET-28a(+)-GchiI经不同浓度的IPTG诱导后,均可明显表达约34KDa的特异蛋白,IPTG浓度为0.6mol/L时,表达效果最佳.图2IPTG诱导表达目的蛋白SDS-PAGE剖析M:蛋白Marker,1-2:未诱导的重组质粒3：0.4mol/LIPTG诱导4：0.6mol/LIPTG诱导5：0.8mol/LIPTG诱导6：1.0mol/LIPTG诱导3.3.表达蛋白对真菌的抑制作用重组E.coliBL21(DE3)菌株经0.6mmol/LIPTG诱导表达之后,经透明圈法测定,沾有无菌水的ACE滤纸处锈腐菌正常生长,沾有粗酶液的BDF滤纸处锈腐菌生长受到抑制,表明表达蛋白对锈腐菌有一定的抑制效果(图3),提示本探究表达几丁质酶具有抑菌活力.图3人参几丁质酶抑菌结果4.探讨植物几丁质酶具有广泛抗细菌.真菌.抗虫等生物学作用.ClassIII类几丁质酶大多为兼具几丁质酶/溶菌酶的双功能酶,可分解细菌细胞壁的肽聚糖,对细菌产生影响.实验证明提纯的烟草.马铃薯.黄瓜.菜豆.豌豆.鹰嘴豆.甜菜.水稻.小麦.大麦.玉米等的几丁质酶对20多种真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用,如灰色葡萄孢Botrytiscinerea[6].立枯丝核菌Rhizoctoniasolani[7].绿色木霉菌Trichodermaviride[8].T.reesei[9].串珠镰刀菌Fusariumsolani等.在AM共生体中,共生相关的几丁质酶能降解有丛枝菌丝释放的几丁质片段,进而组织防御反应的诱导.Salzer等在探讨苜蓿菌根中由AM真菌特异诱导的ClassIII-2,ClassIII-3几丁质酶功能时,认为菌根定殖后期阶段ClassIII几丁质酶的表达与植物防御反应的抑制有关,几丁质酶水解真菌释放的诱导物,使防御反应变弱,从而促进AM真菌与寄主植物间共生关系的建立.本探究表达的ClassIII几丁质酶具有抑制真菌的活性功能,可通过微生物发酵的方式获得大量活性抑菌几丁质酶物质.因此,开展人参几丁质的基因工程探究对培育抗病植物品种,提高作物抗病性具有重要意义.参考文献[1]陈崇顺,朱雪峰,郁志芳.豇豆几丁质酶纯酶液对不同真菌的作用[J].植物保护学报,2000,27(4):375-376.[2]DingXuezhi,LuoZhaohui,XiaLiqiu,etal.Improvingtheinsecticidalactivitybyexpressionofarecombinantcry1Acgenewithchitinase-encodinggeneinacrystalliferousBacillusthuringiensis[J].Currentmicrobiology,2008,56(5):442-446.[3]TokunagaTakaaki,EsakaMuneharu.InductionofanovelXIP-typexylanaseinhibitorbyexternalascorbicacidtreatmentanddifferentialexpressionofXIP-familygenesinrice[J].Plantandcellphysiology,2007,48(5):700-714.[4]KraghKarstenM,HendriksTheo,deJongAnkeJ,etal.Characterzationofchitinasesabletorescuesomaticembryosofthetemperature-sensitivecarrotvariantts11[J].Plantmolecularbiology,1996,31(3):631-645.[5]FeninoElena.GeneticDissectionofOrganellar-Translation-DependentRetrogradeSignallinginArabidopsis[D].lmu,2010.[6]PocockKennethF,HayasakaYoji,McCarthyMichaelG,etal.Thaumatin-likeProteinsandChitinases,theHaze-FormingProteinsofWine,AccumulateduringRipeningofGrape(Vitisvinifera)BerriesandDroughtStressDoesNotAffecttheFinalLevelsperBerryatMaturity[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2000,48(5):1637-1643.[7]MuthukrishnanS,LiangGeorgeH,TrickHaroldN,etal.Pathogenesis-relatedproteinsandtheirgenesincereals[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2001,64(2-3):93-114.[8]MauchFelix,Mauch-ManiBrigitte,BollerThomas.AntifungalhydrolasesinpeatissueII.Inhibitionoffungalgrowthbycombinationsofchitinaseandβ-1,3-glucanase[J].PlantPhysiology,1988,88(3):936-942.[9]ANDERSENM,JENSENArne,ROBERTUSJ,etal.Heterologousexpressionandcharacterizationofwild-typeandmutantformsofa26kDaendochitinasefrombarley(HordeumvulgareL.)[J].Biochem.J,1997,322:815-822.
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