三价的单甲基砷（MAs(III)）是一种剧毒的含砷化合物，其毒性远高于五价的甲基砷类物质。环境中的微生物为了应对MAs(III)的毒性，进化出了多种解毒的机制。本研究通过构建宏基因组文库，从一份具有砷甲基化能力的稻田土壤中鉴定到了一个MAs(III)的解毒机制，该机制中起主要作用的可能是一个含有ArsP类似区域的膜蛋白，推测该膜蛋白的功能可能与ArsP类似，负责MAs(III)的外排。本研究的工作将为后续挖掘微生物中可能存在的新型MAs(III)抗性机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 试剂、菌株及培养基2
1.2 土壤总砷含量的测定及孔隙水中砷形态的变化 2
1.2.1 土壤总砷含量的测定2
1.2.2 土壤的淹水培养及孔隙水中砷形态变化的测定3
1.3 土壤总DNA的提取3
1.4 酶切建库3
1.4.1 测定E．coli菌株DH5α对MAs(III)的抗性3
1.4.2 鸟枪法构建基因文库示意图4
1.4.3 酶切体系建立4
1.4.4 凝胶电泳回收酶切片段4
1.4.5 酶连体系5
1.4.6 转化及基因文库的构建5
1.5 基因序列分析6
2 结果与分析6
2.1 信阳稻田土壤孔隙水中砷形态和含量的变化6
2.2 土壤总DNA提取和Sau3AI酶切6
2.3 阳性克隆子的获得7
2.4 阳性克隆测序和分析8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
利用土壤宏基因组文库鉴定微生物抗MAs(III)的分子机制
引言
砷是一种有毒的类金属元素，在环境中分布广泛。近年来，由于采矿、冶炼、含砷废水的灌溉和含砷农用化学品的使用等人类活动，全球大面积的稻田土壤遭到砷的污染，尤其是南亚及东南亚地区[1,2]。稻田土壤砷污染不仅会 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
影响水稻的生长与产量，还会导致稻米中砷的累积。砷通过稻米进入人体后，会与人体内含硫基的酶结合致其失活，影响人体细胞的正常代谢[3]。如果长期摄入低剂量的砷，砷就会在体内逐渐蓄积，引起慢性中毒，干扰人体正常表皮、神经、呼吸、心血管、造血、免疫、内分泌、肝脏、肾脏、生殖等系统，导致这些系统的功能发生紊乱，引起一系列的疾病[4]。
砷是一种还原性的元素，在淹水的稻田环境中可被微生物转化为甲基砷，例如五价的单甲基砷【MAs(V)】、五价的二甲基砷【DMAs(V)】及五价的三甲基砷，另外它亦可以被转化为挥发性的气态胂。五价甲基砷的毒性一般要比无机的三价砷【As(III)】与五价砷【As(V)】低，但其三价还原态物质的毒性却远高于无机砷。Petrick等[5]使用人体肝细胞评价了MAs(III)的毒性，他发现MAs(III)的细胞毒性远高于As(III)，大约是后者的26倍。稻田环境中甲基砷的另一重要来源是农用含砷化学品如MAs(V)的使用等，当这些五价的甲基砷进入环境后可被微生物还原转化为剧毒的三价甲基砷。Yoshinaga等[6]从佛罗里达州高尔夫球场的土壤中分离得到了一株伯克霍尔德菌，研究发现该菌株可以在室温条件下将土壤富集液中的MAs(V)还原成MAs(III)。MAs(III)的高毒性也迫使环境中的微生物进化出了多种应对机制，例如：ArsP可调控细胞外排MAs(III)[7]，ArsH可将MAs(III)氧化为MAs(V)[8]，ArsI催化MAs(III)的去甲基化[9]，最近发现的一类三半胱氨酸型ArsMs如AfArsM可将MAs(III)进一步甲基化为五价的二甲基砷以及挥发性的气态胂[10]。除此之外，微生物中是否还存在其他的MAs(III)解毒机制，尤其针对特定环境例如稻田土壤中的微生物，我们依然知之甚少。
目前研究土壤微生物的传统方法主要依赖于纯培养微生物的获得，然而已分离的可培养微生物的数量却依然十分有限，这大大限制了该类型方法的应用。宏基因组文库是指一种以环境中的微生物群落为研究对象，以现代基因组技术为研究手段，来研究微生物生理生化特性以及与环境之间关系的微生物新型研究方法[11,12]。简单的说，宏基因组文库是直接研究环境中微生物的DNA，只是从原来研究单个微生物的基因转变为研究整个环境中所有微生物的基因。相对于传统方法，宏基因组文库的优点在于，可避开传统微生物分离培养的过程，直接从DNA水平对环境中那些不可培养的微生物进行研究，从而获取更多有价值的遗传信息。
目前利用这种方法来获取环境中目的基因的技术已经十分成熟。本研究以一份具有砷甲基能力的稻田土壤为实验材料，提取其总DNA来构建宏基因组文库，通过后期的筛选鉴定到一种微生物抗MAs(III)的机制，并研究了该机制背后可能的分子生物学依据。 本研究为今后使用该类方法鉴定环境中MAs(III)的抗性机制打下一个坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 试剂、菌株及培养基
MAs(V)购于南京生利德生物科技有限公司；MAs(III)的合成方法如下：称取Na2S2O3 4.2690 g/L，Na2S2O5 12.5473 g/L，用超纯水溶解后先加MAs(V)至终浓度0.2 mM，后加浓H2SO4至终浓度82 mM，最后用超纯水定容。其他实验用化学试剂均是通过商用途径购买的。构建文库所用的E. coli菌株DH5α购于北京全式金生物有限公司；MAs(III)抗性实验对照菌株用DH5α（pUC19）。实验用培养基的配方如下：LB培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0；SOB培养基（g/L）：蛋白胨 20.0，酵母粉 5.0，NaCl 0.5，KCl 0.186，使用前加入灭菌的MgCl2至终浓度10 mM；ST101培养基（g/L）：蛋白胨 0.5，酵母粉 0.05，葡萄糖 5；配置固体培养基时需加入1.8%（g/v）琼脂粉。

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