噬菌体展示多肽广泛应用于小分子免疫分析，然而非常规性和生物安全性限制其在新型免疫分析方法的开发和应用；且噬菌体展示出的活性多肽连接在噬菌体外壳蛋白上造成整体粒径大、流动性差、对其他实验材料存在安全隐患等不足。通常合成的一价多肽亲和力较差，不能满足免疫分析中对敏感性的检测需求。本研究在前期获得苯噻菌酯模拟表位的基础上，通过固相合成技术合成一价、二价和四价多肽模拟表位，并通过化学方法分别将多肽与上转换发光材料、苯噻菌酯抗体与金纳米花进行偶联，设计基于荧光内滤效应的免疫分析方法(IFE(IA)。用四价多肽建立的免疫分析方法在敏感性方面分别比一价和二价提高6倍和3倍。条件优化后，IFE(IA的饱和信号中浓度和线性检测范围分别为1.81 ng mL(1、2.04(106.17 ng mL(1。该方法与HPLC对实际样品的检测结果具有高度的相关性，线性方程为 y =0.963x + 19.952，决定系数R2 = 0.998。研究表明能够满足苯噻菌酯残留快速检测的分析需求。
目录
摘要.1
关键词.1
Abstract....1
Key words....1
引言......2
1.1试验材料与仪器设备........3
1.1.1试验材料.....3
1.1.2仪器.....3
1.2材料与探针的制备3
1.2.1 抗体....3
1.2.2.1采用水热法合成上转换发光材料......3
1.2.2.2采用种子生长法制备金纳米花......3
1.3探针制备和鉴定....3
1.3.1采用戊二醛交联法制备上转换发光材料（UCNPs）探针.....4
1.3.2采用静电吸附的方法制备金纳米花探针.....4
1.4 基于内滤效应的免疫分析（IFE(IA）...4
1.4.1 IFE(IA步骤....4
1.4.2条件优化.....4
1.4.3特异性评价.....4
1.4.4基质效应和方法评价.....5
1.4.5实际样品检测.....5
2.结果与讨论...5 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 

2.1 纳米材料表征与鉴定.......5
2.1.1 UGNFs和UGNFs探针的表征与鉴定......5
2.1.2 UCNPs和UCNPs探针的表征与验证......5
2.2 IFE(IA检测苯噻菌酯的机制.......6
2.3 UGNFs探针用量、不同价态多肽敏感性的比较.......7
2.4 敏感性.......7
2.5 特异性.......8
2.6 准确性.......9
2.7 实际样品检测.......10
2.8 结论.......10
2.9致谢........10
3.参考文献......11
分支肽模拟表位在苯噻菌酯信号正相关免疫
分析中的应用研究
引言
引言
噬菌体展示多肽是快速筛选小分子模拟表位多肽[3(4]、抗体和酶等的配体[5−7]，并用于开发高敏感性免疫分析方法的有力工具。在小分子分析物的测定方面，可根据筛选结果进行：1）竞争免疫分析[8(11]，即采用多肽模拟表位代替分析物或化学合成的半抗原建立异源竞争免疫分析，以提高方法的敏感性；2）非竞争免疫分析[12(16]，即利用抗免疫复合物多肽与抗原抗体复合物特异性结合，以提高方法的特异性。由于活性多肽连接在噬菌体外壳蛋白上，造成整体粒径大（880×6(7nm）、流动性差和对其他生物材料存在安全隐患等不足，也限制了其在生物领域的应用。此外，噬菌体展示多肽大都是应用在酶免疫分析中，整体试验过程繁琐复杂；辣根过氧化物酶酶标记的抗体是酶免疫分析中另一种必不可少的试剂，导致一步检测难以实现。因此，研究噬菌体展示多肽的替代物对于新型、简便、快速的免疫分析方法的开发具有重要的意义。
通过化学合成的方法将多肽从噬菌体颗粒上分离出来并与纳米颗粒、链霉亲和素、异硫氰酸荧光素（FITC）偶联或将多肽和绿色荧光蛋白、链霉亲和素、荧光素酶等重组表达等已经被证明是建立无噬菌体免疫分析的可行手段[17]。与多肽和蛋白重组表达相比，合成多肽具备更方便、易修饰、纯度高等优点，在小分子免疫分析中应用更为广泛[18(19]。然而，目前合成的多肽都是一价肽，通常结合能力较低（亲和力低），不能满足生物传感器对高亲和力和高敏感性的要求[20]。Takagi等合成的特异性一价多肽与受体结合的亲和力仅为100 µM。Vanrell等合成的一价生物素化多肽不能与草灭达、抗体免疫复合物结合，但是当它通过链亲和素扩展到四价时，活性得以恢复[18(21]。已有研究者报道配体多肽的亲和力不仅依赖于氨基酸序列，而且拷贝数（价态）起着更为重要作用[22(25]。因此，系统的对价态多肽进行研究意义重大。
上转换发光材料(UCNPs)作为一种良好的荧光生物标记材料，具有stock位移大、光稳定性强、背景荧光小等优点[26(28]，在免疫分析中被广泛地用作能量供体[29(30]。相比金纳米球(AuNSs)和金纳米棒(AuNRs)，金纳米花由于尖端效应造成整体电磁场增强，具有比金纳米球和金纳米棒更高的摩尔吸光系数，是一种更好的能量受体[31]。另外，和相同尺寸的金纳米球(AuNSs)、金纳米棒(AuNRs)相比，金纳米花(UGNFs)的复杂多支结构使其拥有更大的比表面积，更高的蛋白质附着效率，更好的胶体稳定性。现在UGNFs已经广泛用于化学和生物分析[32(33]。
本课题在分离得到噬菌体展示模拟表位的基础上，设计合成不同价态的纳米多肽，并通过化学方法分别将纳米多肽与上转换荧光纳米材料、苯噻菌酯抗体与金纳米花进行偶联，设计出基于荧光内滤效应(IFE)的免疫分析传感器，建立了一种简单、灵敏、迅速的信号正相关荧光免疫分析方法，并应用于实际样品中苯噻菌酯的检测。
1、材料与方法：
1.1试验材料与仪器设备
1.1.1试验材料
Ln2O3（Ln=Y，Yb，Er，>99.9%)，NaF，(3氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES，98%），正硅酸乙酯（TEOS，98%），三羟甲基氨基乙烷（99.9%），氨水（≥99.9%）购自阿拉丁工业公司（中国上海）。氯金酸（HAuCl4▪4 H2O，>99.9%），25%戊二醛溶液购自Sinopharm化学有限公司（中国上海）。异丙醇购自天津赛佛科技有限公司(中国天津)。多肽的合成和纯化是由上海楚肽生物科技有限公司合成（中国上海）。

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