疫霉菌隶属于卵菌，可引起毁灭性的植物病害，目前鉴定的100多个疫霉种均是重要的植物病原菌，每年在世界范围内可造成数百亿美元的损失。疫霉菌可以分泌大量的效应因子，干扰植物的防卫反应，促进病原菌的侵染和定殖。根据其在寄主植物中的定位不同，效应因子分为胞外和胞内效应因子两大类。胞内效应因子又包含RXLR和CRN (Crinkler)两类。其中CRN效应因子相对保守，前人已经鉴定了数个效应因子在植物中瞬时表达可引起细胞死亡。然而，目前对CRN效应因子的毒性作用机制还知之甚少。本实验通过克隆4个辣椒疫霉CRN效应因子基因，并在模式植物本氏烟上测试其细胞死亡诱导活性，鉴定到其中一个CRN效应因子可以引发细胞死亡。本研究为进一步利用辣椒疫霉菌-本氏烟模式互作体系研究CRN效应因子的作用机制提供了研究材料。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1供试辣椒疫霉菌株和本氏烟草 3
1.2 酶、其他菌株和试剂3
1.3主要仪器3
1.4 引物设计3
1.5载体构建 4
1.5.1辣椒疫霉菌株的DNA提取4
1.5.2 辣椒疫霉CRN基因克隆 4
1.5.3 PCR产物的回收 4
1.5.4 片段和载体的酶切和回收 4
1.5.5 目的片段与T载体的连接 5
1.5.6 大肠轩菌DH5α感受态细胞的制备 5
1.5.7 热激转化大肠杆菌 5
1.5.8 菌落PCR鉴定 5
1.5.9 质粒酶切验证并测序6
2 诱导烟草细胞死亡的效应分子筛选 6
2.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备 6
2.2农杆菌GV3101感受态细胞的电转化 6
2.3筛选试验7
3 结果与分析7
3.1 通过PCR获得目的基因片段7
3.2 载体构建阳性克隆的获得7
3.3序列分析和比对8
3.4 诱导烟草产生细胞坏死效应分子的筛 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
选8
4讨论 8
致谢9
参考文献9
辣椒疫霉菌CRN效应因子的克隆及其细胞死亡诱导活性分析
引言
疫霉属在形态上虽然同真菌相似,但在进化上却和硅藻与蓝藻关系较近,隶属于茸鞭生物界、卵菌门[1]。目前已经鉴定的100多个疫霉种均是重要的植物病原菌，每年可造成数百亿的经济损失。最臭名昭著的当属引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌(Phytophthora infestans)，该病菌引发了1985年的爱尔兰大饥荒，造成70万人死亡，150万人逃离家园[2]。然而，我们目前对疫霉菌的致病机制还知之甚少。
近年来，包括致病疫霉菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、寄生疫霉菌（Phytophthora parasitica）等几个重要病原疫霉菌基因组测序的完成使得人们对疫霉菌的致病机理有了进一步更进一步的认识[34]。全基因组测序的完成使得大规模分析和鉴定疫霉菌的效应因子基因成为可能。根据效应因子在寄主植物细胞中的定位不同，这些效应因子被分为胞外和胞内效应因子两类[56]。其中胞内效应因子主要包括RxLR效应因子和CRN效应因子两类。
CRN (Crinkler)效应因子是根据其可以引起植物叶片卷曲和细胞坏死而命名的。CRN效应因子的典型结构是蛋白N端具有用于蛋白分泌的信号肽 (signal peptide)，紧接着信号肽包含一个LXLFLAK保守基序，研究表明该蛋白基序同RxLR保守基序类似，可能介导效应因子转运进入植物细胞[78]。CRN效应因子的毒性功能域位于蛋白质的C末端，各个CRN效应因子的C端结构域不尽相同，呈现出多样化的趋势，选择压力分析表明CRN效应因子的C末端受到正向选择作用[910]。目前很多研究已经表明卵菌病原菌RxLR效应分子可以通过RxLR保守基序转运进入寄主细胞，CRN效应因子其N端也具有保守的LXLFLAK序列元件,并以初步证明该基序可以介导效应因子进入植物细胞，然而目前关于效应因子的转运机制仍不是十分清楚，有待于进一步阐明[1112]。
然而近年的研究进展表明大部分的CRN效应因子在植物细胞中表达并不能引发细胞死亡[1314]。到目前为止，仅有少数几个CRN效应因子的毒性性功能被揭示，我们对CRN效应因子的功能及作用机制还了解的有限。我们实验室通过大规模的大豆疫霉菌CRN效应因子克隆和功能分析发现，大部分CRN效应因子不具有细胞死亡诱导活性，反之，许多CRN可以抑制由INF1等PAMP效应因子诱导细胞死亡。
CRN基因家族与NLP和RXLR基因家族相比具有较高的表达量。CRN基因家族总体来说属于组成性表达，其在孢子囊阶段和侵染1.5 h表达量最高,而在侵染后期会有所上调[1516]。本研究拟从辣椒疫霉菌中克隆数个CRN效应因子，并通过农杆菌介导的植物瞬时表达技术，在模式生物本氏烟中测试其是否具有细胞死亡诱导活性。为后续进一步研究CRN诱导植物细胞死亡的机制以及其探讨其细胞死亡诱导活性与毒性功能的关系奠定提供材料。
1 材料与方法
1.1 供试辣椒疫霉菌株和本氏烟草
供试本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和普通烟(Nicotiana tabacum)为本实验室保存,烟草苗的培育参照zhang等的方法,待烟苗长至5叶时供试验用。菌株培养采用10% V8固体培养基，为提取该菌株基因组DNA,从新鲜的菌落边缘切取1:1菌丝块,置于25℃黑暗20mL10%的V8培养液中静置培养3d。
1.2 酶、其他菌株和试剂
高保真DNA聚合酶和限制性内切酶（SmaI和NotI）、DNA聚合酶等均购自TaKaRa公司；、T4DNA连接酶购自Thermo Scientific公司，质粒提取试剂盒、PCR清洁试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物有限公司；另外大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101为本实验室保存。
1.3 主要仪器
台式高速冷冻离心机、小型高速离心机、PCR扩增仪、水平式电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、立式灭菌锅、恒温摇床、电热恒温水浴锅、医用冷藏箱、低温冰箱、烘箱及微波炉。

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