3菠萝泛菌（Pantoea ananatis）是一种革兰氏阴性菌，能够侵染单子叶植物和双子叶植物，引起的病害给农业生产带来严重损失。Ⅵ型分泌系统（T6SS）是近年来革兰氏阴性菌中发现的一种蛋白分泌系统，在植物病原细菌致病过程中起重要作用。本文敲除了菠萝泛菌中存在于基因组上的T6SS-1基因簇及其核心保守基因hcp(tssD)，结果发现，敲除T6SS-1基因簇及hcp(tssD)基因的突变体菌株在玉米、洋葱、土豆上的致病力较菠萝泛菌DZ-12菌株均显著减弱，并且突变体菌株的细菌群体竞争能力也显著降低。
目录
引言
泛菌属在自然界中广泛存在于水体、土壤、植物种子以及动物的体液和伤口[1]。目前泛菌属包括7个种，分别是斯氏泛菌(Pantoes stewarti)、菠萝泛菌（Pantoea ananatis）、成团泛菌（Pantoea agglomerans）、分散泛菌（Pantoea dispersa）、土壤泛菌（Pantoea terrea）、柠檬泛菌（Pantoea citrea）、斑点泛菌[2]（Pantoea punctata）。泛菌属中的很多种都能够引起新的植物细菌性病害。近年来，在我国河北和山东等多地种植的玉米上大规模暴发一种玉米新病害顶腐病。症状表现为叶梢枯死卷曲，叶脉产生黄色病斑，茎秆处黄褐色干腐，感病严重时不能抽穗，给当地玉米生产带来了严重损失。河北省植保植检站姜京宇研究员将玉米顶腐病分真菌性和细菌性2种，其中，细菌性顶腐病经本实验室鉴定，确定该病害由菠萝泛菌（Pantoea ananatis）引起，定名为玉米褐腐病[3]。菠萝泛菌是一种植物病原菌，寄主范围广泛，能引起水稻黑米病[4]、菠萝果腐病[5]，造成洋葱腐烂[6]等，菠萝泛菌对农业生产造成了潜在的威胁，引起人们的对菠萝泛菌致病性的广泛关注[710]。但有关菠萝泛菌在植物上的致病机理的研究尚缺。
在早年的研究中，研究者们从健康的玉米种子分离出3株菠萝泛菌菌株，分别命名为S6、S7、S8，并且这几种不同菌株具有着不同的作用：S6菌株具有共生性，S7菌株存在着弱致病性，S8菌株则是具有有益促生长作用[11]。3个菌株的基因组高度相似，但在蛋白分泌系统，效应分子以及与转座酶、整合酶、噬菌体相关基因上存在着差异，尤其是Ⅵ型分泌系统（type VI se *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
cretion system，T6SS）的差异可能与菠萝泛菌的致病性密切相关。T6SS是广泛存在于革兰氏阴性菌中的一种蛋白分泌系统，在菠萝泛菌中存在的2~3个T6SS基因簇具有不同的生物学功能[12]。其中，T6SS1基因簇是菠萝泛菌在洋葱上致病的关键因子，并且在细菌竞争中起重要作用[13]。本实验室于2016年发现一种玉米新型细菌性病害，命名为玉米褐腐病，并于玉米褐腐病病叶分离出一株菠萝泛菌DZ12菌株。并完成了全基因组测序。生物信息学分析发现DZ12菌株中T6SS1及T6SS3基因簇存在于基因组上，T6SS2基因簇则存在于质粒上，并且T6SS3基因簇只有2个核心保守基因，可能不编码具有致病功能的T6SS。为了明确T6SS1基因簇及其核心保守基因hcp(tssD)的致病性特征及细菌竞争能力，理解T6SS在菠萝泛菌中的致病作用，本实验敲除了T6SS1基因簇及其hcp(tssD)基因，分别构建突变体菌株，测定野生型DZ12菌株与突变体菌株的生长曲线及致病性，并进行细菌竞争能力检测。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
实验菌株来源于2016年本实验室从玉米褐腐病病叶上分离纯化出的菠萝泛菌DZ12菌株，菌株保存于本实验室。
1.2 玉米培养
实验选用“B73”玉米种子，经70%乙醇表面消毒后，无菌水冲洗3次，后用30%次氯酸钠消毒20min，无菌水冲洗3次后备用。黑土及蛭石分装后置于灭菌锅灭菌，以黑土及蛭石的体积比为3:1混匀，加水拌匀后分装至300ml培养杯中，每培养杯中播种3~4粒玉米种子，播种深度为2cm。放置人工气候培养箱培养（人工气候培养箱温度为28℃，光照时间12h/24h），经7d生长后作为玉米三叶期幼苗备用。
1.3 培养基配方
（1）LB液体培养基（酵母胰蛋白胨）：胰蛋白胨（peptone）10g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，酵母提取物（yeast extract）5g/L，蒸馏水溶解，蒸馏水补足1L，pH7.0。121℃高压灭菌20min。
（2）LB固体培养基：1L液体LB培养基中加入15g琼脂（Agar）。
1.4 实验试剂
本实验所使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒来源于OMEGA公司，PCR检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司，核酸染料，Taq酶，Loading buffer等试剂由TaKaRa公司提供，细菌基因组提取试剂盒由天根生化科技有限公司提供。其他试剂购于南京寿德生物科技有限公司，均为分析纯。
1.5 引物设计
引物设计可通过ECrisp:www.ecrisp.org/ECRISP/designcrispr在线工具实现，本实验引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，所用引物序列见表1。
引物名称
Name
引物序列
Sequence
T6SS1F1
AAGGCCAACGAGGCCTCAGATTTTTCCGTTGGGCT
T6SS1R1
GGTCGACTCTAGAGAATTCAAAAAAACGAAATTTCACGCCAGTACA
T6SS1F2
CACCAAGGTAGTCGGCAAATAATACCCAATCCAACTGGATTGC
T6SS1R2
AAGGCCTTATTGGCCAAACTCCCCGAGCTATCATCA

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