小麦赤霉病是我国小麦生产上主要的真菌病害之一，其由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起。它每年给麦类生产带来很大影响，并对全世界粮食生产及安全产生了严重威胁。SNARE蛋白在真核生物的胞吞运输及细胞膜的融合过程中具有重要的作用。前期实验室研究发现SNARE蛋白FgVam7通过参与细胞吞噬和液泡的融合过程，调控禾谷镰刀菌的生长发育、细胞自噬和致病过程。为了进一步掌握其调控细胞自噬的分子机制，首先利用酵母双杂交方法验证24个细胞自噬相关蛋白和FgVam7的相互作用关系，发现FgVam7和其中的5个自噬相关蛋白相互作用；然后进一步通过双分子荧光互补（BiFC）分析它们之间的互作关系。其次通过在BiFC菌株与自噬起始位点（PAS）标记蛋白FgApeI共定位分析，发现FgVam7和5个自噬蛋白的互作位点位于PAS位点；明确了FgVam7的不同功能域和这5个Atg蛋白的作用关系。通过基因敲除方法，发现除了FgAtg17外，其余四个Atg蛋白在禾谷镰刀菌致病机制中起着重要的作用。综上所述，研究结果揭示了SNARE蛋白FgVam7引导的细胞自噬调控网络在禾谷镰孢菌生长发育和致病中的作用，分析其它SNARE蛋白如何调控细胞自噬具有重要的意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1试验菌株及其保存条件...3
1.2 禾谷镰刀菌RNA的提取及cDNA的获得3
1.3 FgATFX基因序列的克隆...................................3
1.4酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补载体（BiFC）构建4
1.4.1酵母双杂交4
1.4.2 双分子荧光互补载体（BiFC）..4
1.5 5个FgATG基因敲除突变体致病力分析4
2 结果与分析4
2.1 酵母双杂交筛选和FgVam7相互作用的自噬相关蛋白 .4
2.2双分子荧光互补（BiFC）进一步验证FgVam7和5个FgAtgX蛋白的互作关系5
2.3 FgVam7和FgAtg6、Fg *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
Atg17以及FgAtg24的互作位点在自噬前体囊组装位点（PAS）5
2.4 FgVam7 SNARE domain和PX motif 与5个FgAtgx蛋白之间的相互作用关系............ ............6
2.5 FgVam7互作的五个自噬相关的蛋白都调控禾谷镰孢菌的致病力.6
3 讨论7
致谢9
参考文献10
附录A 本研究所使用的引物12
附录B 本研究所使用的培养基13
SNARE蛋白FgVam7调控禾谷镰刀菌自噬机制和致病力的分子机制研究
引言
在中国，小麦的种植面积和产量仅次于水稻，是第二大粮食作物，其赤霉病对麦类作物的生产有很严重的影响[1]。长江中下游地区频发的小麦的三大病害是小麦赤霉病、白粉病和纹枯病，尤其赤霉病发生面积最广、发生频率也最高[2]。在民间，烂麦头、红麦头是小麦赤霉病的俗称[3]，其在我国小麦生产的主要粮食产区也有发生，导致小麦减产非常严重。
一般认为，小麦小花和颖片外表面出现褐色、暗紫色到黑色坏死是赤霉病的主要病征和病状表现；在穗花序下方的穗基部可能出现黄化或者变紫，花序组织通常随后变干枯萎蔫，白色至棕色，此外内部的谷粒出现萎缩，麦芒呈无定型，扭曲成结，向下弯曲[4]。在雨季或潮湿的季节，粉红色至橙色的真菌孢子堆通常出现在受感染的小穗、颖片以及小麦谷粒上。穗期为小麦赤霉病的高发期，在此期间很容易发生穗腐病和幼苗枯萎病。小穗腐烂现象出现在小麦扬花后，首先小颖壳出现褐色水渍状斑点，在适当的条件下，这种症状迅速扩展至整株麦穗，小穗就很快失水并变为“白穗”[5]。病种的芽鞘变棕色，后开始腐烂，并伴随根冠腐烂。
近几年，小麦赤霉病逐渐开始在广大地区发生，且发生频率高。据不完全的统计，近年来每年在中国发生面积最广的病害是赤霉病，而且会造成大约20%的产量损失。此外，更严重的是，真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及玉蜀黍赤霉烯酮(ZEA)，通常存在于被感染的小麦中，人和家畜不小心食用后会出现发烧、腹泻、呕吐等症状，对健康产生了很大影响，若家畜怀孕甚至则可能导致流产 [6]。
由于分子生物学方法与技术如基因克隆、遗传转化和基因敲除等的大量普及，在禾谷镰刀菌功能基因的克隆、鉴定、异源表达及其表达调控等分子生物学研究上取得了很大进展[7]，对病原菌致病性和毒素产生相关基因的研究为目前禾谷类镰刀菌功能基因组学的研究重心。研究结果可以帮助我们了解禾谷镰刀菌致病性的分子机制，也成为了预防和控制小麦赤霉病的基础。囊泡参与真菌的生长发育及对寄主的致病过程，也是物质运输途径的主要介导工具。细胞自噬是生物体进化相对保守的细胞内物质降解的一种途径，并且普遍存在于生物体内，在细胞的稳态和功能方面中发挥重要作用；有研究表明，囊泡运输过程的重要细胞器液泡上的SNARE蛋白在自噬体膜与液泡的融合过程中可能扮演着一个非常关键的角色[8]。利用蛋白质组学、分子生物学和遗传学等方法深入研究SNARE蛋白对于细胞自噬机制的作用，对了解其在真菌生长发育和致病过程中的分子调控机制具有理论指导意义。
正常的真核细胞内，存在着一个动态的核酸、蛋白质及细胞器等物质的合成与降解平衡[9]。细胞自噬（autophagy）介导的物质降解途径具有高度的保守性，通过在不同的细胞器之间降解不同的蛋白质并回收利用它们[10]。在酵母中，由双层膜包裹的结构被称为自噬小体，其在PAS（Phagophore Assembly Site）位点组装完成。随后细胞膜延伸将要降解的货物包裹住。自噬小体形成之后，将会随着囊泡运输将其运输到液泡进行降解。货物被降解后一部分物质可以返回到细胞质被循环利用。在生物体的生长发育、程序性细胞死亡、免疫防御、肿瘤抑制、预防神经退行性疾病等多个方面，细胞自噬发挥着非常重要的作用，它与癌症、糖尿病等疾病以及神经衰弱等症状有关[11]。
细胞自噬基于其底物被运输到液泡的方式不同，被分为宏自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)以及分子伴侣介导的自噬(Chaperonemediated autophagy, CMA)[12] 。宏自噬是一般所说的简单细胞自噬，也是目前三种细胞自噬类型里面研究最深入且最广泛的一类细胞自噬，用于降解细胞质中被双层膜的结构（即自噬小体）包裹并最终带入液泡的受损的细胞器和蛋白质 [13]；微自噬是通过溶酶体或者液泡表面倒置变形而直接吞噬细胞质的物质进行降解。
目前的研究证明，除了受自噬相关蛋白的调控外，细胞自噬也受SNARE蛋白等囊泡运输的调控因子调控。在禾谷镰刀菌中，囊泡运输相关基因FgVPS39和FgMON1被报道参与细胞自噬进而调控禾谷镰刀菌生长发育和致病力等过程[14][15]。在稻瘟病菌中，囊泡运输的关键调控因子MoYpt7也通过细胞自噬过程参与稻瘟病菌的营养生长和致病等过程[16]。在模式生物酵母中，研究发现Atg17可以通过与SNARE蛋白Vam7的SANRE domain相互作用，并且可以招募其到PAS点调控细胞自噬过程[17]。所以大多数的观点认为，通过调控生物体囊泡运输过程，SNARE蛋白间接调控细胞自噬过程，从而影响禾谷镰刀菌的生长发育、子囊孢子释放、DON等毒素的产生和致病过程。同时，目前的研究表明，FgVam7与其结合蛋白FgVps39和FgSso1三个相互作用形成一个复合物通过介导囊泡运输过程进而参与到调控禾谷镰刀菌的菌丝的致病力过程；并且发现SNARE蛋白FgPep12和FgVam7相互作用，其也通过参与囊泡运输过程参与调控禾谷镰刀菌的菌丝的致病力过程。

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