NLR受体是植物抗病反应过程中的重要参与者，对于某一特定的抗病反应，常需要Sensor NLR与调节Helper NLR共同参与其中，然而其相互协调，共同激活特异性抗病反应的作用机制，目前尚不清楚。Rpi-bb2与NRC4是符合该作用模式的一组NLR蛋白，为马铃薯等植物提供对马铃薯晚疫病的广谱抗性。本研究针对Rpi-blb2与NRC4的作用机制开展初步探讨，试图阐明其结构、行为与功能的联系。研究发现，发现外源RFP-4Tail或RFP-NRC4可以抑制NRC4介导的免疫反应，而Rpi-blb2的特异性吸器定位是其提供抗性的重要条件。该研究发现了Rpi-blb2与NRC4在功能上的新特性，为进一步揭示其作用机理与信号通路提供了方向。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2微生物材料2
1.1.3基因材料2
1.2 实验方法 2
1.2.1表达载体的线性化处理2
1.2.2目的DNA片段的获取2
1.2.3 Gibson Assembly 3
1.2.4大肠杆菌(Escherichia coli)化学感受态细胞的热激转化3
1.2.5菌落PCR验证 4
1.2.6质粒的抽提与测序4
1.2.7农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化与准备4
1.2.8农杆菌介导的瞬时表达4
1.2.9病毒介导的基因沉默(VIGS) 5
1.2.10致病疫霉(P.infestans)游动孢子的诱导与接种 5
1.2.11疫霉菌病斑的直径测定 5
1.2.12数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 外源RFPNRC4与外源RFP4Tail通过影响NRC4降低烟草对病原物的抵抗力 5
2.1.1 外源RFPNRC4 与外源RFP4Tail使RPI烟草对致病疫霉的抗性下降 5
2.1 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
.2 外源RFPNRC4与外源RFP4Tail使RX烟草对PVX的抗性下降6
2.1.3 结果综合分析7
2.2 改变Rpiblb2的特异性定位不影响其HR功能性，但将降低烟草对致病疫霉的抗性9
2.2.1 TmRpiblb2GFP、Rpiblb2NLSBFP的HR功能性检验9
2.2.2 TmRpiblb2GFP的抗病性检验与分析11
3 讨论12
致谢14
参考文献14
图1 RPI烟草注射侵染实验6
图2 RPI烟草侵染结果统计6
图3 RXVIGS烟草注射侵染实验8
图4 RXVIGS烟草注射侵染结果统计9
图5 TmRpiblb2GFP亚细胞定位情况检验10
图6 Rpiblb2NLSBFP与TmRpiblb2GFP HR功能性检验10
图7 TmRpiblb2GFP抗性实验11
图8 TmRpiblb2GFP侵染成功率统计12
表1 RPI烟草注射侵染结果统计6
表2 RXVIGS烟草注射侵染实验结果统计9
表3 RXVIGS烟草注射侵染实验结果卡方检验的双侧渐进显著性水平9
表4 Rpiblb2NLSBFP与TmRpiblb2GFP HR情况统计11
表5 TmRpiblb2GFP侵染成功率统计12
表6 应用SPSS 23对TmRpiblb2GFP/Rpiblb2GFP与TmRpiblb2GFP/EVGFP病斑直径的成对样本t检验结果12
Rpiblb2与NRC4功能特性的初步探讨
引言
引言
NLR(Nucleotidebinding site and leucine rich repeat；核酸结合、富亮氨酸序列)基因是植物抗病基因中规模最大的一组，具有庞大的数量与丰富的多样性[1]。NLR蛋白的结构具有高度的保守性，均由N端TIR(Toll/Interleukinreceptor)或CC(Coiledcoil motifs)结构域、NBD(Nucleotide binding domain)结构域及C端LRR(Leucinerich repeat)结构域构成[2]。NLR可分为两类：Sensor NLR与Helper NLR，前者负责结合、识别效应因子，后者则介导下游的免疫反应，例如在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)与致病疫霉(Phytophthora infestans)互作过程中，Sensor NLR基因Rpiblb2识别疫霉的效应因子Avrblb2，并在Help NLR基因NRC4的协助下激活免疫反应，引发细胞坏死[3]。
值得注意的是，Sensor NLR与Helper NLR间并非一一对应，而是形成复杂的网络结构，例如NRC4同样参与Rx基因介导的对马铃薯病毒X(PVX）的抗性反应[4]；ChihHang Wu的研究也证明了多种Sensor NLR都与三种的Helper NLR——NRC2、NRC3、NRC4中的一个或数个共同发挥作用。相关的研究认为，这种复杂的对应关系
可能构建了特殊的NLR蛋白信号网络，有助于植物更好地抵抗复杂而多变的病原物[5] 。
NLR蛋白结构的高度保守性被认为与其功能密切相关，例如其LRR结构域涉及对无毒因子的识别与结合，而N端结构与信号的传递有关；NBD结构域则具有ATP酶活性，可以以此调节整个NLR蛋白的作用[3]。较为特殊的是，NRC4蛋白在C端LRR结构域的末端有一个有37个氨基酸残基组成的“尾”部(4Tail)，此前，帝国理工学院生命科学学院的Tolga Bozkurt实验室该“尾”部(4Tail)开展了部分研究，确认NRC4的4Tail缺失突变体(NRC4ΔTail)无法完成吸器定位，而单独的4Tail也不具有吸器定位的性质[6]；实验中常用的N端带有荧光蛋白标签的NRC4具有正常的吸器定位，但不会引发叶片坏死，实验中可利用这一特性标记吸器位置[3]。后续的测试则显示，外源的NRC4ΔTail与完整的GFPNRC4均会抑制烟草HR的发生，而外源的4Tail却不会抑制HR（相关研究尚未发表）。针对这一现象，本人进行了进一步的验证，确认外源RFPNRC4与RFP4Tail对NRC4参与的烟草免疫力均具有抑制作用，且这一抑制作用发生于NRC4相关的信号通路，即Helper NLR阶段。此外，本人还对Rpiblb2的吸器定位特性进行了初步研究，结果显示改变Rpiblb2的定位并不影响其HR功能，但会降低烟草对致病疫霉的抵抗力。这些研究展示了Rpiblb2与NRC4结构与功能的复杂关联，并将有助于进一步阐述Rpiblb2与NRC4蛋白对在抵抗致病疫霉的过程中的作用模式。

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