黄瓜绿斑驳花叶病毒是侵染葫芦科作物的重要病毒，可侵染黄瓜、西瓜等作物引起叶片黄化畸形，生长缓慢，果实大部分黄化甚至坏死，世界许多国家已将此病毒列入检疫性病毒。电化学免疫阻抗检测技术的原理主要是利用抗体与抗原之间的特异性、可逆性结合反应。本课题基于氧化石墨烯构建免疫电化学阻抗传感器，氧化石墨烯和BSA分别作为固定抗体和抗原的介质，将抗体、抗原包被在玻碳电极上，制备免疫传感器，利用循环伏安法、交流阻抗法、差分脉冲伏安法等手段对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行电位扫描，将数据进行处理分析，优化出最合适的抗原、抗体的浓度，绘制标准曲线，从而达到能够在田间快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的目的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验仪器2
1.1.2实验试剂及配制溶液2
1.2方法 2
1.2.1电极预处理2
1.2.2氧化石墨烯的修饰3
1.2.3循环伏安法3
1.2.4交流阻抗法3
1.2.5差分脉冲伏安法3
2结果与分析3
2.1结果3
2.1.1电极预处理后标准曲线的获得3
2.1.2电极包被抗体各梯度浓度的优化4
2.1.3电化学免疫传感器对CGMMV抗原的检测5
2.2分析6
3讨论 7
3.1总结 7
3.2展望 7
致谢8
参考文献8
黄瓜绿斑驳病毒免疫电化学阻抗检测技术
引言
构建三电极体系，其中玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极和铂丝电极分别作为参比电极和对电极，电解质溶液为0.05mol/L的铁氰化钾溶液。
利用循环伏安法，交流阻抗法和差分脉冲伏安法分别对裸电极、用石墨烯修饰过的电极、包被抗体后的电极和包被抗原抗体后的电极进行电位扫描，根据不同浓度的抗体或抗原包被在电极后的电位图，对比之后从而得到对抗原，抗体优化后的结果。
1 材料与方法  *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 

1．1 实验仪器及试剂
1．1．1 实验仪器 上海辰华CHI660D电化学工作站、超声波清洗机、恒温培育箱、玻碳电极、饱和甘汞电极、铂丝电极、移液枪、50ml离心管、称量纸、药匙、电子天平、冰箱、电脑等。
1．1．2 实验试剂及配制溶液 乙醇溶液（C2H50:H2O为1:1）、硝酸溶液（HNO3:H2O为1:1）、氧化石墨烯、铁氰化钾溶液、PBS缓冲溶液（0.15mol/L）、BSA溶液（1%）、特异性抗体4D10（其中初始浓度为5.2mg/ml，并以此为基准稀释6个梯度浓度，分别为10x、20x、40x、80x、160x、320x）、黄瓜绿斑驳病毒（以初始浓度稀释7个浓度梯度，分别为10x、20x、40x、80x、160x、320x、640x）。
铁氰化钾溶液配方（0.5mmol/L）：
铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]） 0.0016g
亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]） 0.0021g
氯化钾（KCl） 0.0746g
超纯水
PBS缓冲溶液配方（0.15mol/L）（pH7.4）：
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g
十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.89g
氯化钠（NaCl） 8g
氯化钾（KCl） 0.2g
超纯水 1L
BSA溶液配方（1%）：
BSA（牛血清白蛋白） 1g
PBA缓冲溶液 100ml
1．2 实验方法
1．2．1 电极预处理 在构建三电极体系之前，需要对工作电极，即对玻碳电极进行打磨清洗预处理，此过程的作用是将工作电极表面活化，使得抗体4D10以及黄瓜绿斑驳病毒抗原更好的包被在电极上，从而使得实验结果更加准确。对电极预处理的第一步为用0.3µm和0.05µm规格的矾土分别对玻碳电极上以8字或画圈形式进行抛光打磨，在打磨期间矾土用加以超纯水浸湿辅助打磨，此过程持续510分钟不等（根据电极老旧程度或其他调整时间）。打磨好后将电极上残存的矾土用超纯水冲洗12次，并放入超声波清洗机中，分别以超纯水、乙醇（1:1）、硝酸（1:1）、超纯水的顺序进行清洗，每一顺序清洗3分钟。在清洗过程中，电极从乙醇溶液放入硝酸溶液中清洗之前，需用超纯水冲洗之后才能放入，以免污染。以此类推，电极从硝酸溶液放入超纯水中清洗，也需用超纯水冲洗之后再放入。清洗结束之后用洗耳球将电极上多余水分吹干或直接风干，并且注意吹的角度，不能倒着吹电极表面，以免加快电极表面的氧化[67]。吹干后即可在电解质为0.5mmol/L铁氰化钾溶液中利用循环伏安法（CV）及交流阻抗法（AV）等方法进行下步实验检测，由此获得循环伏安曲线图及交流阻抗谱图。
1．2．2 氧化石墨烯的修饰 石墨烯是由碳原子组成的一种单层二维六角晶格结构的碳质新材料，它具有独特的性质，热和机械稳定性。由于其内部结构中存在π－π 共轭键，使其具有了电子转移速率快、电化学稳定性好、电位窗口宽、电催化活性高等特点，但是，由于石墨烯具有疏水性，限制了其在电化学中的研究[89]。而氧化石墨烯则因具有COOH和OH等亲水基团，使其具有了亲水性，将氧化石墨烯直接修饰在电极表面后，会提高灵敏度，修饰过程简易，并且使抗体能更加牢固的固定在电极上[1011]。本实验在进行标准曲线的测定之后，用清水冲洗后风干或用洗耳球吹干，用移液枪吸取4µl覆盖在玻碳电极最中央，将其倒置放在37℃恒温培养箱中，计时5分钟使氧化石墨烯风干，即修饰在电极表面上。
1．2．3 循环伏安法 目前电化学研究的所有方法中最常见的是循环伏安法（CV），对于构建好的一个新的电化学体系,针对其研究时往往会选择循环伏安法,可将循环伏安法称为“电化学的谱图”。它是以随时间根据三角波形一次或多次反复扫描为原理，在此过程中记录得到电流一电势曲线,其电势范围是指能使电极上交替发生不同的还原和氧化反应的限度。由所得到的曲线形状可以得知电极反应的可逆程度等。基于此种实验方法的原理，在电化学研究中常用来测量电极反应参数,判断其控制步骤和反应机理,并观察电极表面在整个电势扫描范围内可以发生哪些反应,并且判断其化学性质[12]。

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