二化螟一直是我国重要的水稻害虫之一，其防治主要依赖化学药剂，双酰胺类杀虫剂是近年来防治二化螟的主要药剂，近年来二化螟已经对其产生抗药性，但抗药性机理尚未明确。本试验选取模式昆虫果蝇为试验材料，通过比较二化螟鱼尼丁受体突变型果蝇和野生型果蝇幼虫对氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、溴氰虫酰胺及氟苯虫酰胺的敏感性，来探究二化螟鱼尼丁受体突变是否参与二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗药性。试验结果显示鱼尼丁受体突变型果蝇对四种双酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、溴氰虫酰胺及氟苯虫酰胺的致死中浓度（LC50）分别为1.041mg·L－1、1.757mg·L－1、4.658mg·L－1、8.811mg·L－1，野生型果蝇的致死中浓度分别为0.150mg·L－1、0.590mg·L－1、1.043mg·L－1、4.451mg·L－1，即四种药剂对鱼尼丁受体突变型果蝇的致死中浓度明显高于野生型果蝇，说明鱼尼丁受体突变参与了这四种双酰胺类杀虫剂的抗性，这为进一步研究二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗性机制奠定了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1供试药剂 4
1.1.2供试虫源 4
1.1.3仪器设备 5
1.2方法 5
1.2.1果蝇饲料配方5
1.2.2毒饲料配方5
1.2.3果蝇产卵板配方 5
1.2.4杀虫剂对果蝇幼虫的生物活性测定5
1.2.5数据统计与分析6
2结果与分析6
2.1杀虫剂对两种品系果蝇幼虫的生物活性6
2.2 小结6
3 讨论7
致谢 7
参考文献 8
表1供试药剂成分及生产厂家 5
表2杀虫剂对果蝇幼虫的生物性 6
鱼尼丁受体突变型果蝇对双酰胺类杀虫剂敏感性变化
引言
引言
二化螟是鳞翅目螟蛾科昆虫，是我国水稻上最常见的害虫之一。其在分蘖期危害水稻会导致枯鞘和枯苗；在孕穗期、抽穗期 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
危害水稻会导致枯孕穗；在灌浆期、乳熟期危害水稻会导致半枯穗和虫伤株，蛀食水稻茎部，田间为害呈现聚集分布，为害中心明显。中国稻区的二化螟分布广泛，远超三化螟和大螟，二化螟的发生主要集中在长江流域稻区和南方稻区，最近几年的二化螟的发生明显加重[1]。长期以来，二化螟的防治主要依靠化学防治，而新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺等双酰胺类杀虫剂由于其独特的作用机理是近年来防治二化螟的主要杀虫剂。
目前双酰胺类杀虫剂在大田中广泛被应用防治二化螟，本实验室从2010年就开始对田间二化螟对氟苯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺进行监测[27]，2013年就监测到浙江种群对氯虫苯甲酰胺产生低水平抗性， 2014年监测发现有中等水平的二化螟抗药性种群出现,之后二化螟对该类杀虫剂的抗性持续升高。2015年监测到浙江象山种群对氯虫苯甲酰胺（15.058.7倍）和氟苯虫酰胺达到中等水平抗性（87.9倍），安徽庐江、湖北监利和江西南城三个种群对氯虫苯甲酰胺产生了中等水平抗性(14.722.0倍），2016年发现超过23%的二化螟种群对氯虫苯甲酰胺已经产生高水平抗性（123.0433.7倍）。
为探究抗性产生的原因，在对双酰胺类杀虫剂的抗性机制的研究工作中，发现田间不同抗性水平的小菜蛾种群中鱼尼丁受体发生不同的突变位点，在小菜蛾种群中第一次发现了G4946E[8]突变，之后陆续在小菜蛾对双酰胺高抗种群中检测到多个突变，包括E1338D、Q4594L和I4790M，并在小菜蛾中研究发现了I4790M和G4946E参与了其对双酰胺类杀虫剂抗性的产生。在二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗药性机制研究中，二化螟中也检测到了G4910E、I4790M和Y4667D/V[6、9]突变位点，但其在双酰胺类杀虫剂抗性中的作用还未被证实。
CRISPR/Cas9 技术是一种基因编辑技术，其基本原理就是将rRNA设计为引导 RNA，引导 RNA 含有位于5端的靶DNA 的互补序列和位于3端的cr RNA 的类似序列，从而利用靶 DNA 的互补序列来定位需要编辑的位点，并通过cr RNA 的类似序列与Cas9 结合，对DNA序列进行敲除、插入等修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以直接在植物的基因组上进行研究并且因为它设计操作简单与编辑高效等优点成为植保领域进行基因功能研究和改良作物中重要的研究手段之一[1011]，拥有广阔的应用前景。为了探究靶标突变对双酰胺类杀虫剂抗性的贡献。为验证鱼尼丁受体突变是否参与二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗性机制，本研究通过CRISPR/Cas9技术对模式昆虫果蝇鱼尼丁受体基因进行编辑，构建二化螟鱼尼丁受体突变型果蝇，并通过比较鱼尼丁受体突变型果蝇和野生型果蝇对双酰胺类杀虫剂的敏感性，来验证这些突变是否参与二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗药性，为双酰胺类杀虫剂的毒理学研究奠定基础。
1.材料与方法
1．1 材料
1.1.1 供试药剂
供试原药（表1）根据物理性质不同可以分为两类，其中氟苯虫酰胺原药、氯虫苯甲酰胺原药和阿维菌素原药易溶于有机溶剂，而溴氰虫酰胺制剂、四氯虫酰胺制剂易溶于水。氟苯虫酰胺原药、氯虫苯甲酰胺原药和阿维菌素原药先以丙酮为溶剂配制成母液（1×10^4mgL－1），根据试验所需浓度再用丙酮按比稀释成多个浓度梯度；溴氰虫酰胺制剂、四氯虫酰胺制剂先以水为溶剂配成母液（1×10^4mgL－1），根据试验所需浓度用水按比稀释成多个浓度梯度，供之后配置毒饲料时使用。
1.1.2 供试虫源
本试验所需的两个品系黑腹果蝇，其中W118品系（野生型）黑腹果蝇来源自东南大学生科研究院潘玉峰教授课题组，鱼尼丁受体突变型黑腹果蝇(RyR）由大学植物保护学院杀虫剂毒理与抗药性试验室通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建
表1 供试药剂成分及生产厂家
Table 1 composition and manufacturers of tested chemicals
杀虫剂
Insecticide
有效成分含量
A.I. %
药剂类型
Insecticide group
生产厂家
Manufacturer
氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprole
95%
双酰胺类
先正达（中国）投资有限公司
四氯虫酰胺
Tetrachloromide
10%

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