本研究以形态学鉴定为基础，对采自马来西亚的18个瘿螨样本进行形态学分析，共鉴定出13个属，其中包括3个新属。使用MEGA软件，过马来西亚沙巴地区采集的样本的核糖体18S rRNA、28S rRNA和线粒体COI、12S rRNA，进行序列同源比较，用K2P模型计算样本建的遗传距离，数据结果表明18个样本所划分的13个属之间的遗传距离远大于2%，证明了形态学鉴定的结果是准确的，为接下来的种类分类打下基础，同时也为后续瘿螨系统发育的分析奠定了基础。关键词 : 马来西亚，瘿螨，COI，12S rRNA，18S rRNA，28S rRNAAbstractThis study was based on morphological identification. Morphological analysis was performed on the 18 samples collected. A total of 13 genera were identified, including 4 new genera and 3 unknown genera. Then the ribosomal 18S rRNA, 28S rRNA, and mitochondrial COI and 12S rRNA of the samples collected from Sabah, Malaysia were sequence-homologously compared. The genetic distances of the samples were calculated using the K2P model using MEGA software. The data showed that 18 The genetic distance between the 13 genera divided by the samples is much greater than 2%, which proves that the results of morphological identification are accurate, lays the foundation for the next category classification, and also lays the fou *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
ndation for subsequent analysis of phylogeny development. basis.Key words: Malaysia, Eriophyoid, COI, 12S rRNA, 18S rRNA, 28S rRNA瘿螨是一类世界性分布的植食性螨类，也是农业害虫中体型最小的类群。其体长仅0.15毫米，刺吸式口器，蠕虫形、梭形或者蠋形，初呈淡黄色，后变为橙黄色、乳白色、淡棕色或淡红色。若螨、成螨仅有两对足，又称四足螨；前肢体段背呈盾状；后肢体段延长，具许多环纹；腹部末端渐细，末节背面两根长毛[1]。瘿螨在全球广泛地分布，种类繁多，目前超过4400个种类被报道[2]。瘿螨分类研宄最早开展的地区是欧洲，其中奥地利学者Nalepa最先建立了瘿螨科，并发表了13个属，共约450种瘿螨[3]。美国人Keifer 一生致力于瘿螨分类研宄，他发表了大量的瘿螨属种，共记载了113个属，约700个种，完善了瘿螨总科分类系统，使美国的瘿螨研究快速发展[4]。在东亚，中国、日本做了较多的瘿螨分类研究。中国古北界有286种占中国瘿螨总科的36.81%，约占世界古北界瘿螨总科的19.79%[1]。中国东洋界己知瘿螨总科种类超过185属800种，瘿螨科超过145属600种[5]。至2009年，东南亚己知瘿螨104属325种，其中植羽瘿螨科仅2种，瘿螨科261种，羽爪瘿螨科62种。其中泰国记载206种，印度尼西亚103种，菲律宾17种，新加坡6种，马来西亚和越南各3种，缅甸1种[6]，柬埔寨、老挝、文莱、东帝汶尚未有瘿螨报道。 大多数瘿螨的寄主植物种类比较单一，绝大部分的瘿螨属于单食性或寡食性，以成、若螨刺吸植物内部液体，主要危害植物的地上幼嫩组织如叶、芽、花、嫩茎和幼果等。受害的植物叶片会形成叶锈或毛毡；受害的芽膨大，形成芽瘤，造成植物不能正常发芽、抽叶和开花；花受害的结果就是植物不能正常结果；果实受到瘿螨的为害后，会造成果实的品质下降，商品价值下降；植物茎干受到瘿螨危害后，会造成丛枝，影响植物的正常生长。除直接危害农作物外，瘿螨还能传播植物病毒。随着分子技术的快速发展，DNA条形码技术的完善，更多的学者使用该技术研究瘿螨。因为核酸位点中含有大量的遗传信息，并且由于瘿螨体内不同基因进化速率的不同，通过计算机软件的同源分析以及遗传位点分析，可适合瘿螨各阶元的研究。核糖体DNA保守序列区由于进化速率相对较线粒体基因慢，因此核糖体DNA较为适合瘿螨高阶元的进化研究等，而线粒体DNA更适合于属、种水平间的研究[8]。再加上DNA提取技术的发展，DNA 提取试剂盒以及纯化试剂盒的出现，不仅解决了瘿螨个体微小难提取DNA的问题，而且可以减少DNA的污染，避免DNA被破坏。目前，植羽瘿螨科Phytoptidae的分子数据认为是单系群，其他两个科，瘿螨科Eriophyidae、羽爪瘿螨科Diptilomipidae的单系性均得不到支持，但是由于植羽的取样较少，所以某种程度上它的单系性也受到一定质疑。1 材料与方法1.1 供试材料瘿螨科物种样本采集于马来西亚沙巴地区特鲁斯马迪山脉。它们的采集时间，寄主植物和样本颜色特征见表1。采集后样本保存在100%的无水乙醇中， 提取的DNA保存于-20℃冰箱中。表1所用瘿螨物种编号物种属名拉丁文采集日期颜色1上瘿螨属Epitrimerus sp.2017.4.30淡黄色2顶冠瘿螨属Tegonolophus sp.2017.4.30淡黄色3新沟瘿螨属Neovittacus sp.2017.5.1淡黄色4无毛瘿螨属Asetidicrothrix sp.2017.5.1白色5新缺节瘿螨属Neometaculus sp.2017.5.1白色6新副同足瘿螨属Neoscolotosus sp.2017.5.1淡红色7新刺瘿螨属Neospinaetergum sp.2017.5.2白色8新属1New genus 12017.5.2淡红色9双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.12017.5.2淡红色10新属2New genus 22017.5.2淡红色11双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.22017.5.2白色12双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.32017.5.2淡黄色13双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.42017.5.3淡黄色14新畸瘿螨属Neojutarus sp.2017.5.3淡黄色15新属3New genus 32017.5.3淡黄色、白色16畸瘿螨属Abacarus sp.2017.5.3淡黄色17双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.52017.5.3淡黄色18双羽爪瘿螨属Diptilomiopus sp.62017.5.5淡黄色1.2 瘿螨总DNA的提取 瘿螨DNA的提取采用的是QIAGEN试剂盒提取瘿螨DNA 步骤准备离心管，加入180µL Buffer ATL至离心管底部；挑取单头瘿螨进入离心管中；离心管放入金属浴锅56℃ 450r 摇浴12h；取出离心管晾至室温，加入20µL蛋白酶K ，离心；离心管放入金属浴锅56℃ 450r 摇浴3d；取出离心管晾至室温，加入200µL Buffer AL，加完立即充分摇匀（使反应完全），产生白色沉淀，离心；离心管放入金属浴锅56℃，加热20 min 左右至沉淀完全溶解；取出离心管晾至室温，加入200µL 无水乙醇，充分摇匀（1− 2 min）至油状澄清；用移液枪将离心管内的液体全部（约为600mL）移入试剂盒配备的离心管滤柱中，静置（> 5 min），8000 rpm离心1 min，弃下液（把下半部分的离心管直接丢弃）；保留滤柱，换上备用离心管后，在滤柱中加入500µL Buffer AW1，静置（> 5 min），8000 rpm离心1 min，弃下液（把下半部分的离心管直接丢弃）；保留滤柱，换上备用离心管后，在滤柱中加入500µL Buffer AW2，静置（> 5 min），14000 rpm离心3 min，弃下液（把下半部分的离心管直接丢弃）；保留滤柱，换上处理后的普通离心管（盖上盖子，剪去连接部分，待移入滤柱时再丢弃盖子），打开滤柱盖子，放置在超净工作台内吹干残留酒精；在滤柱中加入100µL Buffer AE，静置（> 5 min），8000 rpm离心1 min；将离心所得液体全部加入滤柱中，静置（> 5 min），8000 rpm离心1 min，将下液（即所提取的DNA）移入PCR管保存。1.3 PCR扩增体系和条件1.3.1线粒体DNA COI 使用一对特异性引物从瘿螨样本线粒体DNA的COI基因中扩增出一段453bp的片段。上游引物为LCO1490 下游引物为HCO2198每25μL扩增反应体系含2μL DNA模板，9.5μL ddH2O，12.5μL MgCl2 （25 mmol/L），上游和下游引物各0.5μL（20 μmol/L each）。PCR反应条件为94℃预变性3min；接着94℃ 30s，46℃ 30s，72℃ 1min共35个循环；然后在72℃ 5min进行延伸；最后在10℃中保存扩增产物的检测取PCR反应产物3μL，在1.0%（g/mL）的琼脂糖凝胶上400V电压电泳30min，最后在Gel Doc EQ凝胶成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA）下观察。1.3.2 线粒体DNA 12S rRNA使用一对特异性引物从瘿螨样本线粒体DNA的12S rRNA基因中扩增出一段352bp的片段。上游引物为12 SA下游引物为12 SBPCR反应条件为94℃预变性3min；接着94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min共35个循环；然后在72℃ 5min进行延伸；最后在10℃中保存每25μL扩增反应体系以及扩增产物的检测方法与线粒体DNA-COI 相同 1.3.3 核糖体DNA 18S rRNA使用五对特异性引物从瘿螨样本线粒体DNA的18S rRNA基因中扩增出一段2273bp的片段。上游引物为①18sfw ②fw390R ③fw770R ④fw961 ⑤fw1462下游引物为①rev480R ②rev771 ③rev960R ④rev1460 ⑤rev18SPCR反应条件为94℃预变性3min；接着94℃ 30s，TM 30s （①52℃ ②55 ℃ ③46℃ ④49℃ ⑤55℃），72℃ 1min共35个循环；然后在72℃ 5min进行延伸；最后在10℃中保存 每25μL扩增反应体系以及扩增产物的检测方法与线粒体DNA-COI 相同 1.3.4 核糖体DNA 28S rRNA 使用三对特异性引物从瘿螨样本线粒体DNA的28S rRNA基因中扩增出两个区域片段d2-5和9-10上游引物为1.d2-5: ①ND2f ②28S3F 2..d9-10: ③28S9F下游引物为1.d2-5: ①D2R ②28s3R 2..d9-10: ③28S9RPCR反应条件为94℃预变性3min；接着94℃ 30s，TM 30s （①55℃ ②55 ℃ ③52℃ ），72℃ 1min共35个循环；然后在72℃ 5min进行延伸；最后在10℃中保存 每25μL扩增反应体系以及扩增产物的检测方法与线粒体DNA-COI 相同 1.4 PCR产物纯化及序列测定产物扩增后，将成功扩增的片段交由南京通用生物公司进行PCR产物纯化，所有测序工作也均由南京通用生物公司完成，测序结果通过邮件进行反馈。1.5 序列分析通过Geneious 软件查看测序结果，找到引物并截取目的片段；将截取片段导入到MEGA 5.0[9] 软件中，对序列进行编辑，然后进行序列同源比较以及DNA序列饱和度分析，最后采用Kimura-2 Parameter[10]模型计算18个属之间的遗传距离。2 结果与分析2.1 基于COI的序列差异及饱和度分析本实验研究了来自马拉西亚沙巴地区瘿螨科10个属共13个样本，其中包括3个新属的线粒体COI片段。该片段长度为424bp左右，差异在±3bp。变异位点269个，占63.1%；简约信息位点216个，占50.7%。序列的碱基组成A42.0%，G18.5%，C15.5，T23.9，AT平均含量65.9%。经过MEGA 5的计算，10个样本的两两核苷酸差异统计结果见表2，属间核苷酸差异表3。由表3我们可以看出，Diptilomiopus sp.与Neojutarus sp.差异只有0.185，而与其他8个属核苷酸差异均大于0.31，远远高于Diptilomiopus sp.的属内遗传距离。然而，其他9个属的样品中只包括一个物种，我们无法比较种内种间的核苷酸差异。Diptilomiopus sp.的4个样本的两两遗传距离为0.315与属内遗传距离相近差异，总体上，属间差异明显大于样本间差异。表2 瘿螨COI序列的样本间遗传距离1 2345678910111213120.38430.0000.38440.3540.4080.35450.4510.4320.4510.38860.3800.4040.3800.3610.36570.3560.4270.3560.3330.3810.31180.4400.4160.4400.4400.4300.3640.34290.4080.4300.4080.4700.4420.3120.3540.446100.4090.4130.4090.4680.4400.3890.3750.3890.396110.0000.3840.0000.3540.4510.3800.3560.4400.4080.409120.4950.4660.4950.5120.5100.4840.4730.5260.4880.5550.495130.4130.4250.4130.3380.4110.3830.3830.4160.4890.4570.4130.528注1-4 Diptilomiopus sp. 1、3、4、6；5 Abacarus sp.；6 Asetidicrothrix sp.；7 Neometaculus sp.；8 Nevittacus sp.；9 Neoscolotosus sp.；10 Neospinaetergum sp.；11 Neojutarus sp.；12 新属1；13 新属3表3 瘿螨COI序列的属内属间遗传距离12345678910属内10.31420.43130.3810.36540.3680.3810.31150.4340.4300.3640.34260.4290.4420.3120.3540.44670.4250.4400.3890.3750.3890.39680.1850.4510.3800.3560.4400.4080.40990.4920.5100.4840.4730.5260.4880.5550.495100.3970.4110.3830.3830.4160.4890.4570.4130.528注1 Diptilomiopus sp.； 2 Abacarus sp.； 3 Asetidicrothrix sp.；4 Neometaculus sp.； 5 Nevittacus sp.； 6 Neoscolotosus sp.； 7 Neospinaetergum sp.； 8 Neojutarus sp.； 9 新属1； 10新属32.2 基于线粒体12S rRNA的序列差异分析本实验研究了来自马拉西亚沙巴地区瘿螨科13个属共18个样本，其中包括3个新属线粒体12S rRNA片段。该片段长度为335-365bp，变异位点313个，占85.6%；简约信息位点258个，占66.0%。序列的碱基组成A28.9%，G10.8%，C12.1，T48.2，AT平均含量77.1%。经过MEGA 5的计算，属间核苷酸差异表4，18个样本的两两核苷酸差异统计结果见表5。由表4我们可以看出，Diptilomiopus sp.与其他12个属核苷酸差异均大于0.40，远远高于Diptilomiopus sp.的属内遗传距离。Diptilomiopus sp.的6个样本差异有明显的跨度，样本1、2、6的遗传距离在0.20之上，而样本3、4、5，的则小于0.06，平均遗传距离为0.236。总体上，属间差异明显大于属内样本差异，属内差异大于样本间差异。表4 瘿螨12S rRNA序列的属内属间遗传距离12345678910111213属内10.21820.61030.4040.56940.4300.5070.35450.4330.5850.4430.47160.4460.6300.4980.4530.43870.5000.6020.5120.4980.5000.59580.5130.6360.5260.5190.4100.3160.59090.5630.5760.4710.4640.5000.6490.4710.653100.4250.6130.4650.4430.2960.3440.4860.3620.563110.5170.7590.5000.5530.5450.6840.6440.5960.7210.637120.4370.6070.4850.3720.4040.4440.5280.5010.4810.3660.530130.4740.4780.4360.4850.5850.5140.5900.5760.5140.5680.5860.471注1 Diptilomiopus sp.；2 Abacarus sp.；3 Asetidicrothrix sp.；4 Epitrimerus sp；5 Neometaculus sp.；6 Tegonolophus sp.；7 Neovttacus sp.；8 Neoscolotosus sp.；9 Neospinaetergum sp.；10 Neojutarus sp.；11 新属1；12新属2；13 新属3表5 瘿螨12S rRNA序列的样本间遗传距离123456789101112131415161718120.28130.2810.22240.3040.2480.04750.3040.2480.0470.00060.3310.2800.2270.2270.22770.6590.6430.6030.6040.6040.54980.4650.4170.3600.3860.3860.4110.56990.4730.4640.3920.3990.3990.4520.5070.354100.4450.4440.4370.4240.4240.4230.5850.4430.471110.4500.4420.4640.4420.4420.4390.6300.4980.4530.438120.5140.5540.4610.4670.4670.5350.6020.5120.4980.5000.595130.5860.5370.5010.5080.5080.4370.6360.5260.5190.4100.3160.590140.5390.6010.5450.5690.5690.5530.5760.4710.4640.5000.6490.4710.653150.4440.4070.4410.4330.4330.3930.6130.4650.4430.2960.3440.4860.3620.563160.5850.5450.4710.4850.4850.5290.7590.5000.5530.5450.6840.6440.5960.7210.637170.4570.4710.4230.4240.4240.4230.6070.4850.3720.4040.4440.5280.5010.4810.3660.530180.4730.4570.4790.4790.4790.4780.4780.4360.4850.5850.5140.5900.5760.5140.5680.5860.471注1-6 Diptilomiopus sp. 1-6；7 Abacarus sp.；8 Asetidicrothrix sp.；9 Epitrimerus sp.；10 Neometaculus sp.；11 Tegonolophus sp.；12 Neovttacus sp.；13 Neoscolotosus sp.；14 Neospinaetergum sp.；15 Neojutarus sp.；16 新属1；17新属2；18 新属32.3 基于核糖体18S rRNA的序列差异分析本实验研究了来自马拉西亚沙巴地区瘿螨科13个属共18个样本，其中包括3个新属核糖体18S rRNA片段。该片段长度为2177-2328bp，变异位点928个，占38.1%；简约信息位点619个，占25.6%。序列的碱基组成A26.7%，G26.3%，C20.4%，T26.7%，AT平均含量53.4%。经过MEGA 5的计算，属间核苷酸差异见表6，18个样本的两两核苷酸差异统计结果见表7。由表6我们可以看出，Diptilomiopus sp.与其他12个属核苷酸差异在0.06-0.17之间，远远高于Diptilomiopus sp.的属内遗传距离。Diptilomiopus sp.的属内样本差异不明显，6个样本的平均遗传距离为为0.043，样本1、2、6的遗传距离在0.03-0.06之间；而样本3、4、5的序列完全一致，没有差异。总体上，属间差异明显大于属内差异，样本间差异大于属内样本差异。表6 瘿螨18S rRNA序列的属内属间遗传距离12345678910111213属内10.01820.09530.0640.09340.0600.0950.05650.0640.0940.0630.05760.1120.1190.1210.1130.11970.0740.1060.0760.0680.0760.10980.1150.1250.1220.1150.1140.0570.11090.0900.1040.0870.0900.0710.1240.0860.123100.0690.0710.0700.0740.0730.1170.0840.1120.096110.0830.1140.0900.0910.0920.1390.1080.1340.1120.094120.0590.0980.0630.0540.0590.1130.0670.1120.0870.0750.089130.1660.1650.1610.1680.1590.1950.1720.1990.1710.1710.1910.166注1 Diptilomiopus sp.；2 Abacarus sp.；3 Asetidicrothrix sp.；4 Epitrimerus sp.；5 Neometaculus sp.；6 Tegonolophus sp.；7 Neovttacus sp.；8 Neoscolotosus sp.；9 Neospinaetergum sp.；10 Neojutarus sp.；11 新属1；12新属2；13 新属3 表7 瘿螨18S rRNA序列的种间遗传距离123456789101112131415161718120.02930.0180.03540.0180.0350.00050.0180.0350.0000.00060.0110.0310.0140.0140.01470.0940.1000.0930.0930.0930.09480.0580.0740.0630.0630.0630.0600.09390.0570.0700.0590.0590.0590.0550.0950.056100.0620.0740.0620.0620.0620.0620.0940.0630.057110.1120.1140.1110.1110.1110.1120.1190.1210.1130.119120.0710.0830.0740.0740.0740.0700.1060.0760.0680.0760.109130.1100.1210.1160.1160.1160.1100.1250.1220.1150.1140.0570.110140.0870.0970.0890.0890.0890.0860.1040.0870.0900.0710.1240.0860.123150.0620.0780.0700.0700.0700.0620.0710.0700.0740.0730.1170.0840.1120.096160.0750.0870.0860.0860.0860.0780.1140.0900.0910.0920.1390.1080.1340.1120.094170.0560.0710.0570.0570.0570.0560.0980.0630.0540.0590.1130.0670.1120.0870.0750.089180.1640.1790.1630.1630.1630.1630.1650.1610.1680.1590.1950.1720.1990.1710.1710.1910.166注1-6 Diptilomiopus sp 1-6；7 Abacarus sp.；8 Asetidicrothrix sp.；9 Epitrimerus sp.；10 Neometaculus sp.；11 Tegonolophus sp.；12 Neovttacus sp.；13 Neoscolotosus sp.；14 Neospinaetergum sp.；15 Neojutarus sp.；16 未新属1；17新属2；18 新属32.4 基于核糖体28S rRNA序列差异分析本实验研究了来自马拉西亚沙巴地区瘿螨科13个属共18个样本，其中包括3个新属的核糖体28S rRNA片段D 2-5区域和D 9-10区域。前者长度为896-957bp，变异位点499个，占49.8%；简约信息位点395个，占39.4%。序列的碱基组成A25.0%，G28.6%，C20.4%，T26.1%，AT平均含量51.1%。后者长度为726-756bp，变异位点523个，占66.7%；简约信息位点186个，占23.7%。序列的碱基组成A26.8%，G26.5%，C19.7%，T27.0%，AT平均含量53.8%。经过MEGA 5的计算，D 2-5区域的属间核苷酸差异见表8，18个样本的两两核苷酸差异统计结果见表10，；D 9-10区域的属间核苷酸差异见表9，两两核苷酸差异统计结果见表11。由表8表9我们可以看出，D 2-5区域Diptilomiopus sp.与其他12个属核苷酸差异明显，远大于属内遗传距离，D 9-10区域Diptilomiopus sp与其他12个属核苷酸之间的差异不如D 2-5区域明显，并且其属内遗传距离明显小于D 2-5区域。表10显示出D 2-5区域Diptilomiopus sp.的6个样本的平均遗传距离为0.118，6个样本间有明显差异，远大于属内遗传距器；18个样本遗传距离差异明显。而表11的结果则显示出D 9-10区域Diptilomiopus sp.的6个样本平均遗传距离为0.048，小于属内遗传距离；18个样本之间的遗传距离在0.12之下，远小于D 2-5的遗传距离，但样本8与其他样本的遗传距离大于1。表8 瘿螨28S rRNAD 2-5区域序列的属内属间遗传距离12345678910111213属内10.09920.20030.2110.25840.1650.2110.21050.1870.2500.1860.16760.2140.2060.2630.2240.23670.1920.2120.1930.1560.1600.21180.2040.2020.2380.2110.2170.1130.19890.2220.2510.2290.1710.1360.2360.1780.234100.2190.2580.1910.1990.1880.2710.2110.2600.215110.2240.2590.2250.2220.2150.2580.2250.2460.2430.250120.1820.1920.1810.1280.1630.2230.1280.2070.1880.1800.199130.2720.2740.2510.2480.2590.3250.2530.2860.2750.2620.2580.247注1 Diptilomiopus sp；2 Abacarus sp.；3 Asetidicrothrix sp.；4 Epitrimerus sp.；5 Neometaculus sp.；6 Tegonolophus sp.；7 Neovttacus sp.；8 Neoscolotosus sp.；9 Neospinaetergum sp.；10 Neojutarus sp.；11 新属1；12新属2；13 新属3表9 瘿螨28S rRNAD 9-10区域序列的属内属间遗传距离12345678910111213属内10.03620.08931.1421.21740.0920.1021.20150.0950.0961.1300.11160.1080.1241.1300.1020.14670.1060.1311.1520.0930.1140.09780.1070.1261.1640.0980.1370.0760.10690.0980.0931.1240.1020.0480.1260.1020.129100.1160.1071.1520.1000.1240.1150.1250.1050.128110.1010.1071.2070.1200.1220.1510.1260.1200.1200.131120.0970.1141.0790.0620.0930.0850.0900.0930.0840.0980.116130.1340.1431.2700.1150.1400.1370.1240.1260.1180.1350.1650.120注1 Diptilomiopus sp.；2 Abacarus sp.；3 Asetidicrothrix sp.；4 Epitrimerus sp.；5 Neometaculus sp.；6 Tegonolophus sp.；7 Neovttacus sp..；8 Neoscolotosus sp.；9 Neospinaetergum sp.；10 Neojutarus sp.；11 新属1；12新属2；13 新属3表10 瘿螨28S rRNAD 2-5区域序列的种间遗传距离123456789101112131415161718120.18930.0810.19440.0790.1940.00150.0790.1940.0010.00060.0820.1870.0660.0650.06570.2040.2220.1960.1940.1940.18780.1970.2910.1950.1930.1930.1940.25890.1530.2390.1480.1490.1490.1530.2110.210100.1760.2710.1710.1690.1690.1680.2500.1860.167110.1980.1890.2310.2310.2310.2050.2060.2630.2240.236120.1810.2650.1740.1760.1760.1810.2120.1930.1560.1600.211130.1960.2270.2030.2030.2030.1950.2020.2380.2110.2170.1130.198140.2170.2830.2080.2070.2070.2080.2510.2290.1710.1360.2360.1780.234150.2150.2880.2010.2030.2030.2070.2580.1910.1990.1880.2710.2110.2600.215160.2170.2900.2060.2060.2060.2160.2590.2250.2220.2150.2580.2250.2460.2430.250170.1790.2550.1640.1650.1650.1670.1920.1810.1280.1630.2230.1280.2070.1880.1800.199180.2770.3200.2600.2580.2580.2630.2740.2510.2480.2590.3250.2530.2860.2750.2620.2580.247注1-6 Diptilomiopus sp. 1-6；7 Abacarus sp.；8 Asetidicrothrix sp.；9 Epitrimerus sp.；10 Neometaculus sp.；11 Tegonolophus sp.；12 Neovttacus sp.；13 Neoscolotosus sp.；14 Neospinaetergum sp.；15 Neojutarus sp.；16 新属1；17新属2；18新属3表11 瘿螨28S rRNA D9-10区域序列的种间遗传距离12345679101112131415161718120.05830.0340.06940.0340.0690.00050.0340.0690.0000.00060.0370.0670.0250.0250.02570.0830.0930.0900.0900.0900.08881.1901.1661.1231.1231.1231.1271.21790.0950.1110.0860.0860.0860.0910.102100.0950.1070.0890.0890.0890.0980.0960.111110.1140.1150.1070.1070.1070.1000.1240.1020.146120.1020.1240.1020.1020.1020.1060.1310.0930.1140.097130.1110.1240.1020.1020.1020.1040.1260.0980.1370.0760.106140.0980.1140.0930.0930.0930.0980.0930.1020.0480.1260.1020.129150.1220.1220.1130.1130.1130.1130.1070.1000.1240.1150.1250.1050.128160.1020.1110.0980.0980.0980.1000.1070.1200.1220.1510.1260.1200.1200.131170.0960.1200.0910.0910.0910.0890.1140.0620.0930.0850.0900.0930.0840.0980.116180.1330.1430.1310.1310.1310.1330.1430.1150.1400.1370.1240.1260.1180.1350.1650.120注1-6 Diptilomiopus sp. 1-6；7 Abacarus sp.；8 Asetidicrothrix sp.；9 Epitrimerus sp.；10 Neometaculus sp.；11 Tegonolophus sp.；12 Neovttacus sp.；13 Neoscolotosus sp.；14 Neospinaetergum sp.；15 Neojutarus sp.；16 新属1；17新属2；18 新属33 讨论本研究是以形态学鉴定为基础，首先对马拉西亚沙巴地区18个样本进行形态学鉴定，共鉴定出13个属，包括3个新属。然后基于线粒体COI和线粒体12S rRNA、核糖体18S rRNA、28S rRNA D2-5及 D9-10区域作为分子条形码对马拉西亚沙巴地区的样本分别进行分子鉴定。其数据结果表明，不论是线粒体COI、12S rRNA还是核糖体18S rRNA、28S rRNA D2-5及 D9-10区域，总体上属间差异大于属内差异。但是核糖体18S rRNA和28S rRNA D9-10的结果显示18个样本的遗传距离在0.10左右，而线粒体COI、12S rRNA和28S rRNA D2-5的遗传距离则在0.20之上，这一结果与线粒体、核糖体核苷酸序列进化速率有关，线粒体基因组虽然具有遗传结构简单、基因顺序和组成总体上保守的特点[11,12]，但是其mtRNA的取代速率远高于核糖体DNA[13]。28S rRNA D2-5与D9-10区域的数据结果差异明显，可能是因为28S rRNA包含的信息量大，序列长度长，再加上mtRNA的取代可能是从D1区域开始，而D2-5区域与D1区域相近，D9-10区域与D1区域远，所以D2-5区域的序列进化程度远大于D9-10区域。 通过分子鉴定，可以有效地验证马来西亚沙巴地区的18个样本的形态学鉴定的准确性。线粒体COI和线粒体12S rRNA、核糖体18S rRNA、28S rRNA D2-5及 D9-10区域的数据都显示出属间遗传距离差异明显，说明对18个样本的形态学的分类是准确的， Diptilomiopus sp.的6个样本的核糖体12S rRNA、18S rRNA和28S rRNA的数据可以说明样本Diptilomiopus sp. 3、4、5遗传距离小于2%，序列基本一致，所以这三个样本同源性很高，很有可能是同一种。而样本Diptilomiopus sp 1、2、6遗传距离大于2%，可以确定是不同的3个种，为接下来的种类分类打下基础，同时也为后续瘿螨系统发育的分析奠定了基础。4 致谢参考文献[1] 薛晓峰. 中国古北界瘿螨总科（蜱螨亚纲前气门目）的分类研究[D]. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料2
1.2 瘿螨总DNA的提取3
1.3 PCR扩增体系和条件 4
1.3.1 线粒体DNA COI 4
1.3.2 线粒体DNA 12S rRNA4
1.3.3 核糖体DNA 18S rRNA5
1.3.4 核糖体DNA 28S rRNA5
1.4 PCR产物纯化及序列测定 5
1.5 序列分析5
2 结果与分析6
2.1 基于COI的序列差异及饱和度分析6
2.2 基于线粒体12S rRNA的序列差异分析 7
2.3 基于核糖体18S rRNA的序列差异分析 10
2.4 基于核糖体28S rRNA序列差异分析 12
3 讨论 16
致谢 16
参考文献 17
马来西亚沙巴地区瘿螨分子鉴定研究
植物保护 张熠玚
引言

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