瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的一种严重的世界性病害，瓜类细菌性果斑病菌可以侵染多种葫芦科作物，如甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜等，自报道以来已在美国、澳大利亚、以色列、土耳其、泰国、伊朗、匈牙利、巴西、日本、希腊和我国多个省份发生，给当地的西瓜甜瓜种植业造成了严重的损失。此病是典型的种传细菌性病害，病原为嗜酸菌属西瓜种( Acidovorax citrulli)。此课题主要是研究利用氧化石墨烯修饰后的电化学免疫传感器能否应用到细菌性果斑病的田间快速检测中。电化学免疫传感器是利用抗体与抗原的识别和结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置，将系统生物技术和电子技术结合起来，可用于分子识别，进行高灵敏和高选择性检测。本实验构建三电极系统，运用循环伏安法、交流阻抗法、差分脉冲法检测出细菌性果斑病抗原和抗体结合的最佳浓度，从而方便田间对细菌性果斑病的快速检测，为该种病害的防治做出贡献。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1电极预处理 2
1.2.2氧化石墨烯修3
1.2.3抗体修饰3
1.2.4抗原修饰3
2结果与分析4
2.1结果4
2.2分析7
3讨论8
3.1总结...........................................................................................................8
3.2展望.....................................................................................8
致谢.......9参考文献9
细菌性果斑病免疫电化学阻抗检测技术
植物保护学院 高慧鸽
引言
引言：瓜类细菌性果斑病菌可以侵染多种葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等，自报道以来已在 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
泰国、美国、澳大利亚、土耳其、日本、以色列、伊朗、匈牙利、巴西、希腊和我国多个省份发生，给当地的西甜瓜种植业造成了严重的损失[1]。瓜类细菌性果斑病菌为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，着生单根极生鞭毛，不产生荧光，在生长过程中对氧气的要求非常严格。菌体正常生长温度为41℃以下，若生长环境在4℃以下则停止生长。此种细菌在KB培养基上长出的菌落呈现乳白色、圆形、光滑、全缘、隆起、不透明状，菌落直径一般为1 ～ 2mm。该菌引起烟草过敏反应结果不一致，不产生精氨酸水解酶，明胶液化力弱，氧化酶和 2 － 酮葡糖酸试验阳性[2]。
瓜类细菌性果斑病具有传播速度快、发病迅速、爆发性强等特点，这些特点使得该病害难以防控，自发现以来已成为影响我国瓜类生产的主要病害之一。因此，掌握瓜类细菌性果斑病的发生规律和防治技术对于控制该病的大规模发生，对我国农业研究具有十分重要的意义。在过去的防治中，对该类病菌的检测方法有荧光分析、液一质联用、高效液相色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法等。但是这些方法具有操作繁琐，仪器昂贵的缺点，因此这些方法不能广泛推广。电化学分析技术因其仪器简单、分析成本低、对环境污染小、灵敏度高且易于自动化而备受人们的关注，成为目前的研究热点，具有广大的应用前景。在本课题中，免疫电化学阻抗传感器是基于氧化石墨烯构建的，氧化石墨烯具有二维晶体结构，是碳纳米材料家族的新成员。石墨烯系列材料有着一系列优异的物理化学性质，其独特的结构使其在研究中发挥了重要的作用，其性质如高热导性和高机械强度，室温下的量子霍尔效应，双极性电场效应等，在电化学传感器方面具有广阔的应用前景。本文制备了氧化石墨烯修饰电极(GO/GC），研究了细菌性果斑病菌在该修饰电极上的电化学行为，修饰过程简易，灵敏度高，有望应用到田间对细菌性果斑病的快速检测中。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验仪器及试剂 电化学工作站（上海辰华CHI660D）、超声波清洗器、恒温箱、电子天平、冰箱、砂纸、0.3µm和0.05µm矾土、三电极体系（饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，玻碳电极或修饰电极为工作电极）。
1．1．2 实验试剂 无水乙醇、硝酸、铁氰化钾溶液、PBS缓冲液（0.15mol/L）、BSA溶液、氧化石墨烯、抗体5A3(其中初始浓度为6.4mg/ml，并以此为基准稀释6个梯度浓度，分别为10x、20x、40x、80x、160x、320x)、抗原（细菌性果斑病病菌）（以初始浓度稀释7个浓度梯度，分别为10x、20x、40x、80x、160x、320x、640x）。
试剂配方：
乙醇溶液：C2H50:H2O 1:1
硝酸溶液：HNO3:H2O 1:1
0.5mmol/L铁氰化钾溶液配方：
铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]） 0.0016g
亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]） 0.0021g
氯化钾（KCl） 0.0746g
超纯水
PBS缓冲溶液配方（1L）（pH7.4）：
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.27g
十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.89g
氯化钠（NaCl） 8g
氯化钾（KCl） 0.2g
超纯水
BSA溶液(1%):
BSA 1g
PBS（0.15mol/L） 100mL
1．2 实验方法
1．2．1 电极预处理 将玻碳电极取出，先将0.3µm的矾土倒在湿润的纱纸上，用玻碳电极在纱纸上打磨，用手腕控制打磨的力度，力度不可过大，注意玻碳电极的垂直，不可倾斜打磨，整个打磨过程呈“8”字形或圆形；510min后换0.05µm的矾土打磨，手法同之前一样，打磨510min后用超纯水冲洗掉电极上的矾土，然后放入超纯水中超声波清洗，再依次放在1:1硝酸溶液、1:1乙醇溶液和超纯水中超声波清洗，各清洗3min。在清洗过程中，电极从硝酸溶液放入乙醇溶液中清洗之前，需用超纯水冲洗之后才能放入，以免污染。以此类推，电极从乙醇溶液放入超纯水中清洗，也需用超纯水冲洗之后再放入。

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