稻瘟病是一种世界性的稻作病害，对人类粮食安全有着极大的影响。目前，防治稻瘟病采用的是以选用抗病良种为前提，农业防治为中心，适时采用化学防治的治理策略，而深入认识了解稻瘟病的致病分子机制是防治该病的基础。酿酒酵母Knr4是连接影响细胞壁合成，形态发生和细胞周期进程的信号传导途径的特征性IDP枢纽[1]。CWI途径和钙调磷酸酶途径是控制细胞壁合成和完整性的两种主要途径，Knr4蛋白与这两条途径中的关键蛋白都互作。分别与CWI的Slt2 MAP激酶[2]和钙应答途径的磷酸酶钙调磷酸酶互作[3][4]。实验室前期利用免疫共沉淀的方法，鉴定到致病因子MoMps1与MoKnr4相互作用，通过基因敲除MoKNR4，获得突变体菌株，发现MoKnr4参与调控了稻瘟病菌的生长、产孢、致病性等一系列生理过程，但MoKnr4究竟是如何调控这一系列的生物学过程，仍需进一步的实验加以证明。本研究以MoKnr4为诱饵蛋白进行酵母筛库实验，通过测序获得与BD-MoKnr4互作的片段60个，运用BioEdit软件进行分析，进一步进行比对分析，共获得16个未移码片段。选择其中同源度高的几个片段与BD-MoKnr4进行一对一互作验证，获得两个基因片段MGG_04614和MGG_15163与BD-MoKnr4互作，并进一步对其进行敲除，为进一步阐明MoKnr4致病分子机理提供基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1构建筛库诱饵载体5
1.2.2 酵母感受态制备5
1.2.3 酵母筛库5
1.2.4 阳性酵母质粒提取5
1.2.5 酵母质粒转化入大肠杆菌.......6
1.2.6 阳性质粒的获得6
1.2.7 酵母双杂交进行一对一互作验证6
1.2.8 构建互作蛋白编码基因敲除载体6
1.2.9 稻瘟转化7
1.2.10敲除突变体的功能分析7
2结果与分析7
2.1酵母双杂交实验初步筛选7
2.2阳性克隆测序 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
比对分析9
2.3阳性克隆与诱饵质粒一对一互作验证9
2.4敲除载体构建与基因敲除10
2.5敲除突变体的功能分析11
3讨论11
4 致谢12
参考文献12
稻瘟病菌MoKnr4结合蛋白的鉴定与功能分析
引言
稻瘟病是一种世界性稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失达 11%~30%[5]。稻瘟病菌可在很多种植物上寄生，除水稻外，还包罗小麦、大麦等非常重要的经济作物。其中稻瘟病菌侵染水稻每年给水稻产量带来庞大的损失，进一步破解稻瘟菌侵染过程，对科研工作者来说是挑战也是机会。随着蛋白质组学的发展，对侵染途径中的关键蛋白的深入了解成为了进一步工作的突破口，而在蛋白质互作网络中连接信号通路的蛋白质成为枢纽蛋白，这种蛋白无疑是我们研究工作重要的突破口。
稻瘟病菌是一种丝状真菌，自然条件下主要以无性态分生孢子（两隔三细胞）进行传播和侵染。随着气流或雨水的传播，无性态分生孢子落在植物表面，感受到植物表面信号以后，开始萌发产生芽管，芽管进一步萌发在其顶端形成附着胞，附着胞产生巨大的膨压产生侵入钉寄主表面，并且进一步在寄主细胞内扩展。病斑表面产生分生孢子，从而完成一轮侵染循环[6][7]。
在酿酒酵母中，Knr4在甲壳素沉积以及细胞壁组装中有着重要的调节作用，是连接影响细胞壁合成，形态发生和细胞周期进程的信号传导途径的特征性IDP枢纽。CWI途径和钙调磷酸酶途径是控制细胞壁合成和完整性的两种主要途径，Knr4蛋白与这两条途径中的关键蛋白都互作，分别为CWI的Slt2 MAP激酶和钙应答途径的钙调磷酸酶。因此，Knr4成为了这两条信号传导途径中的一个连接节点。Knr4在酵母中的作用研究比较清楚，但是在丝状真菌中的生理生化作用报道甚少。实验室前期利用免疫共沉淀的方法，鉴定到致病因子MoMps1与MoKnr4相互作用，通过基因敲除MoKNR4，获得突变体菌株，发现MoKnr4参与调控了稻瘟病菌的生长、产孢、致病性等一系列生理过程，但MoKnr4究竟是如何调控这一系列的生物学过程，仍需进一步的实验加以证明。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究所采用的菌株及培养条件
稻瘟病菌：野生型菌株Guy11 培养环境：28℃ 避光培养
酵母菌株：AH109 培养环境：30℃ 避光培养
大肠杆菌：DH5α/JM109 培养环境：37℃ 培养
1.1.2 研究所使用的培养基
CM培养基（10 g 葡萄糖；2 g 蛋白胨；1 g 酵母提取物；1 g 酪蛋白氨基酸；25 ml 40×氮盐；1 ml 金属离子；1 ml 维他命；3 g 琼脂粉；定容至1 L）；TB3培养基（3 g 酵母提取物；3 g 酪蛋白提取物；200 g蔗糖；定容至1 L）；LB培养基（10 g 胰蛋白胨；5 g 酵母提取物；10 g Nacl ；定容至1L）；YPD培养基（10 g 酵母提取物；20 g 蛋白胨；20 g 葡萄糖；定容至1L）；二缺、三缺、四缺培养基（0.64 g SD/Leu/Trp；SD/His/Leu/Trp；SD/Ade/His/Leu/Trp粉末；5 g 硫酸铵；20 g 葡萄糖；1.7 g Yeast Nitrogen Base without Amino Acids without Ammonnium Sulfare；4 g Agar A；定容至1L）
1.1.3 主要试剂
酵母转化试剂盒；酵母质粒提取试剂盒；PTC、STC；2% CTAB；氯仿；无水乙醇；氨苄；卡那霉素等。
1.2 方法
1.2.1 构建筛库诱饵载体
在稻瘟病菌数据库中找到MoKNR4的基因序列，以稻瘟菌cDNA为模板进行PCR扩增，之后电泳验证目的片段，大小正确进行跑胶回收，酶切骨架pGBKT7以及目标片段，过夜连接后转化入大肠杆菌感受态细胞。验证正确后摇菌送测序，测序正确用于后续转化实验[8]。
1.2.2 酵母感受态的制备
（1）在制备酵母感受态细胞前一天晚上摇菌，挑取AH109菌板上的单菌落至指定培养基中，摇培16 h。
（2）400 g，4 ℃，5 min，冷冻离心，弃上清。
（3）为洗去表面培养基,将细胞在10 ml TE缓冲液中洗涤，混匀后，400 g，冷冻离心5 min，倒掉上清。
（4）将沉淀于5 ml醋酸锂溶液中摇匀，注意动作要轻缓。66 rpm的摇床上培养半小时。
（5）400 g， 4 ℃，5 min，冷冻离心，弃上清。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561614.html