生防假单胞菌（Pseudomonas spp.）能通过产生大量的抑菌活性物质和高效植物根部定殖能力等，起到防治植物病害的作用。因此，研究这类菌的活性物质调控机理和定殖规律，能为提高活性物质的产量和菌株的环境竞争能力，提供理论依据。本课题前期分析发现，生防假单胞菌P. protegens Pf-5菌株的脂肽orfamide A合成操纵子（ofa）内存在一个未知功能的luxR（PFL2143）转录调控因子，通常操纵子内的这类因子能调控物质的合成。因此为了研究该转录调控因子的功能，我们构建了Pf-5ΔluxR突变体和Pf-5ΔluxR/p-luxR回补体，其生物膜和群集运动经检测表明，与野生型菌株Pf-5相比，突变体Pf-5ΔluxR的生物膜和群集运动能力都显著下降，而回补体Pf-5ΔluxR/p-luxR则能恢复这两种表型。我们又利用绿色荧光蛋白编码基因标记了这些菌株，通过观察荧光，进一步确定该LuxR因子的确能影响菌株的生物膜形成能力。脂肽orfamide A是一种表面活性剂，是这类菌株群集运动所必需的，因此我们推测，该luxR基因PFL2143可能通过影响orfamide A的合成来影响生物膜和群集运动的表型。后续研究正在进行当中。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1供试材料4
1.1实验试剂与器材 4
1.1.1实验试剂4
1.1.2实验器材4
1.2供试菌株与质粒 4
1.2.1菌株与质粒4
1.2.2菌株培养方法5
1.3培养基与抗生素5
1.3.1培养基5
1.3.2实验试剂5
2试验方法5
2.1获取Pf5菌株luxR基因PFL2143缺失体5
2.1.1 Pf5菌株基因组的提取 6
2.1.2 PCR扩增PFL2143上、下游片段 6
2.1.3 DNA片段的纯化回收 7
2.1.4连接和转化 7
2.1.5 Pf5的转化9
2.1.6菌落PCR验证 9
2.2 获取P *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
f5菌株PFL2143基因回补体9
2.2.1 PCR扩PFL2143基因 9
2.2.2回收扩出片段10
2.2.3连接10
2.2.4转化10
2.3 观测Pf5菌株PFL2143基因缺失体、回补体、野生型的生物膜表型10
2.3.1荧光标记蛋白方法观测生物膜10
2.3.2结晶紫染色方法观测生物膜10
2.4 观测Pf5菌株PFL2143缺失体、回补体、野生型的群集运动表型 11
3 结果与分析11
3.1 Pf5ΔPFL2143突变体构建11
3.1.1扩充左右臂11
3.1.2融合片段与酶切验证12
3.1.3 Pf5ΔPFL2143突变体的验证12
3.2 luxR基因PFL2143对生物膜的影响13
3.2.1结晶紫方法观测生物膜表型13
3.2.2绿色荧光蛋白标记方法观测生物膜表型13
3.3luxR基因PFL2143对群集运动的影响14
4讨论14
致谢15
参考文献15
生防假单胞菌Pseudomonas protegens Pf5菌株的一个LuxR转录调控因子功能研究
引言
引言：生防假单胞菌（Pseudomonas spp.）是一种典型的可在植物根系周围促进生长的细菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）。这类细菌能够吸收作物分泌的一些渗出物质来供给自身的生存生长繁殖，能分泌多类抑制有害菌生长的物质，还可以定殖在植物根系周围[1]。该大类下的一些菌株现已被开发并应用于植物病害的生物防治中，如ESC10和A506等[2]。国内发现并商业化开发的铜绿假单胞菌M18菌株和荧光假单胞菌2P24菌株等也对一些植物病害有较好的防治能力[34]。还有一些假单胞菌分泌产生的抗菌物质已经被商业化开发用于在杀菌剂领域，如硝吡咯菌素（pyrrolnitrin,Prn）衍生出的拌种咯和咯菌腈[5]。
生防假单胞菌P. protegens Pf5菌株，原本归属在荧光假单胞菌属（P. fluorescens ）下，是研究人员从棉花根际土壤分离得到的。该菌株对于细菌、真菌和卵菌等引起的植物病害都有一定防治效果。Pf5菌株的全基因组现已被测序完毕，因此能对它进行较准确的遗传操作，如基因敲除、基因沉默、转基因等，目前是研究生防假单胞菌的模式菌株[6]。Pf5菌株能够通过非核糖体途径合成活性物质，如嗜铁素：Pyochelin和pyoverdine，这些活性物质使得该菌株能够对植物病害的防治起到作用。如新鉴定的脂肽类物质（orfamide A），就具有抑制真菌活性的能力[78]。而2,4二乙酰基间苯三酚（2,4diacetylphloroglucinol, DAPG）能够降低细菌、真菌和卵菌的生长指标值[6]，还能作为激发植物自身的系统抗病性（Induced systemic resistance，ISR)来主动抵抗外界的侵扰[9]；硝吡咯菌素对菌核病菌和丝核病菌有较强抑活能力[10]；藤黄绿脓菌素（Pyoluteorin, Plt）具有抑制卵菌和细菌活性的能力[11]；挥发性抑菌物质氢氰酸（Hydrogen cyanide, HCN）可防治土传病害[6]。
生防假单胞菌的群体感应系统（Quorum Sensing, QS）是活性物质调控网络很重要的一部分。群体感应，是细菌之间对周围环境变化作出反应并进行信号分子交流的调节机制[12]。QS系统由I基因和R基因组成，它们属于控制基因。I基因可指导细菌自体诱导物合成酶——Lux I蛋白的合成，Lux I蛋白能够催化信号分子酰基高丝氨酸内酯(Nacyl homoserine lactone，AHLs)的合成。而当信号分子在细胞外累积到一定浓度时，这些信号分子会通过不耗费能量的运输方式进入细菌细胞膜内，激活R基因的转录翻译，合成LuxR型蛋白。信号分子再与LuxR结合，结合体能促进相关基因的表达，以供给生物被膜所需的功能性蛋白等。多数 AHL 型群体感应是通过Lux I/R类型调控来传递信号分子。此外，QS系统还能调节生物发光、游动性等微生物群体行为[1316]。

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