为了解甜菜夜蛾G4946E突变与二酰胺抗性的相关性并分析其适合度代价，本研究通过CRISPR /Cas9技术将鱼尼丁受体（RyR）G4946E突变引入到甜菜夜蛾。结果表明甜菜夜蛾4946E品系与野生型相比分别对氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、氟虫双酰胺产生了223，336和>1000倍的抗性。与WHS品系相比，4946E、4946E♂×WHS♀和4946E♀×WHS♂品系的相对适合度分别为0.51,0.89和0.80。本研究结果不仅证实了在相同的遗传背景下RyR G4946E突变体对二酰胺杀虫剂的高水平抗性，而且还证明了甜菜夜蛾G4946E突变具有适合度代价。因此，二酰胺杀虫剂与其他类型的杀虫剂轮换使用，有助于延缓甜菜夜蛾抗药性的发展。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 昆虫品系及饲养条件3
1.2 杀虫剂种类及生物测定3
1.3 生命表的构建和相对适合度的计算3
1.4 数据分析3
2 结果与分析 3
2.1 4946E品系对二酰胺杀虫剂的敏感性 4
2.2 甜菜夜蛾WHS、4946E、4946E♂×WHS♀、4946E♀×WHS♂的适合度特征4
2.3 甜菜夜蛾各品系的相对适合度5
3 讨论 5
3.1 4946E品系对不同二酰胺杀虫剂的抗性差异 5
3.2 4946E品系的单点突变对发育阶段的特异性影响5
3.3 4946E与WHS品系的适合度差异6
致谢6
参考文献6
甜菜夜蛾G4946E突变对二酰胺杀虫剂的抗性及适合度分析
引言
甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）属鳞翅目夜蛾科，该类害虫以危害大田作物和蔬菜为主，故研究其发生具有十分重要的农业经济价值。二酰胺杀虫剂由于其有利的生物性、生态性、及毒理性已成为防治鳞翅目害虫最常用的杀虫剂之一，但抗药性是对该类杀虫剂使用年限的主要威胁[1]。
二酰胺类杀虫剂，如氟虫双酰胺和氯 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
虫苯甲酰胺，属于一种新型杀虫剂，是昆虫RyR的激活剂，能延长RyR通道开放，导致中毒害虫的肌肉收缩不协调。RyR是位于内质网上的钙通道[1]，由钙激活，负责控制内部钙的释放，因兴奋收缩偶联作用而得名。哺乳动物体内有三种RyR蛋白，而昆虫只表达一种[2]。昆虫RyR是二酰胺杀虫剂的靶标，二酰胺杀虫剂在昆虫肌肉中选择性地结合RyR[3]，导致肌质网内部不受控制地释放钙，使得昆虫停止取食、嗜睡、肌肉麻痹，最后死亡。
迄今为止，鉴定二酰胺抗性的基本机制主要是昆虫RyR跨膜结构域中的靶位点突变[4]，而其他代谢机制，如过表达的解毒酶尚未在鳞翅目昆虫中得到证实。关于G4946E突变体对二酰胺抗性的功能性证据，结合小菜蛾胸膜制剂，已通过研究放射性配体得到证明。RyR G4946E突变已经在三种鳞翅目害虫中报道，包括小菜蛾[5]、番茄潜麦蛾[6]和二化螟[7]，然而该突变在体内的功能验证也只是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在果蝇中进行过[8]。
基因组编辑技术，特别是基于CRISPRCas体系的编辑技术，正在不断加快生物学研究的进程。CRISPR/Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具，可通过将基因组DNA显微注射到受精卵中，对有机体进行基因修饰，从而引入精确、针对性的变化。该系统可以在定义的位点处引入双链断裂（DSB），通常通过非同源末端连接（NHEJ）或同源性指导（HDR）来修复[9]。NHEJ易于出错，因为无法预测插入或缺失（indel）突变的大小和类型，所以这些indel突变通常会产生移码现象，使蛋白质丧失功能。而HDR需要同源序列的供体模板才可以将期望的DNA片段插入到靶位点中[10]，故通过这种方式，基因可被靶向破坏，称为敲除（KO），或用作靶序列插入的对接位点，称为敲入（KI）。所以，CRISPR/Cas9技术凭借其强大的特异性和适用性，可对靶标序列进行快速修饰。
有关CRISPR/Cas9在昆虫中应用的报道日益增多，主要集中在黑腹果蝇，家蚕和埃及伊蚊等。该技术不仅在功能基因组学的研究中变得越来越流行[10]，也成为控制潜在害虫和媒介传播疾病的一类工具。通过利用CRISPR/Cas9技术，Zuo等人证明了SePgp（甜菜夜蛾Pgp蛋白）对阿维菌素和甲维盐（EB）敏感性的重要作用[11]，且实验结果表明CRISPR/Cas9系统在甜菜夜蛾中可成为一种高效的基因工程技术工具。此外在棉铃虫中[12]，在可控的遗传背景条件下，这项技术已经通过引入抗性突变来验证有关于Bt的抗性机制。
针对某类生物种群而言，适合度指的是该类生物在所处环境中生存并将其性状遗传给子代的能力。当无药剂选择时，抗性基因的适合度表现出不利性，这种与抗性基因适合度有关的劣势被视为适合度代价[13]。由于以代谢和发育过程为代价，资源和能量会进行再分配[13]，故抗性基因的过表达被认为会导致适合度代价。Crow曾预测抗性等位基因在没有选择的情况下应该是不利的[14]，这个假设已经在许多昆虫中得到证实。相对于亲代敏感品系，小菜蛾虫酰肼类抗性品系仅具有0.3倍的相对适合度[15]。同时该实验表明在发育为成虫之前，昆虫抗性个体的存活率与敏感品系相比较低，成虫的交配率和有效生殖力以及抗性昆虫虫卵的孵化率也显著降低。苹果蠹蛾溴氰菊酯抗性品系与敏感品系相比，雌虫繁殖力低，幼虫发育时间较长[16]。抗性品系体重较轻，抗性雄虫的成虫寿命较短，抗性品系表现出高适合度代价。因此，整体适合度的特征可包括孵化率，繁殖力，死亡率等相应昆虫发育参数。
然而，大多数已发表的实验面对的难题是适合度代价受到昆虫种群遗传背景的影响[17]。田间抗性品系和敏感品系在遗传背景上存在差异，难以确定适合度代价。实验室中保存多代的敏感品系比田间采集品系更适合实验室条件。除非在相似的遗传背景下比较，否则不能保证实验所测效果确实是由抗性等位基因所致[18]。为了减少遗传背景差异引起的复杂性，只能通过敏感品系与抗性品系大量回交构建与敏感品系几乎同源的昆虫品系。故由于种群的遗传背景可能会影响与抗性有关的适合度代价[17]，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术引入突变使编辑品系和敏感品系的区别只存在于基因组突变位点，这是评估适合度代价的最佳模型。

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