本试验采用药剂驯化以及紫外诱导的方法筛选小麦赤霉病菌对戊唑醇的抗性菌株，对筛选出的菌株进行CYP51测序，检测其是否有点突变。同时对实验室保存的田间菌株进行鉴定，区分出了禾谷镰孢菌（Fg）和亚洲镰孢菌（Fa）。对有点突变的菌株以及Fa和Fg菌株采用菌落生长直径法测定其对三唑类药剂的敏感性，包括苯醚甲环唑、丙硫菌唑、咪鲜胺、氟环唑、种菌唑、叶菌唑、戊唑醇。结果表明BM-16为疑似抗性菌株，抗性倍数较其他菌株更高，药剂驯化菌株BM-50-7以及紫外诱导菌株UV2021-3较其他菌株对三唑类杀菌剂的敏感性降低。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 供试菌株 2
1.1.2 供试药剂 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 小麦赤霉病菌抗药性筛选 2
1.2.1.1 抗性菌株的药剂驯化 2
1.2.1.2 抗性菌株的紫外诱导 2
1.2.2 小麦赤霉病菌抗药性鉴定 3
1.2.2.1 培养基的制备3
1.2.2.2 含药平板制备及药剂敏感性测定3
1.2.3 小麦赤霉病菌基因组的克隆、鉴定及序列分析 3
1.2.3.1 小麦赤霉病菌基因组DNA的提取3
1.2.3.2 PCR技术4
1.2.3.3 PCR产物检测 4
2 结果分析 4
2.1 唑类杀菌剂靶标甾醇14α脱甲基酶基因（CYP51）的序列分析4
2.1.1实验室抗药性菌株的药剂驯化以及序列分析4
2.1.2 实验室抗药性菌株的紫外诱导及序列分析5
2.1.3 田间菌株的Fg与Fa菌株的CYP51A序列分析5
2.2 药敏性测定6
2.2.1 禾谷镰孢菌和亚洲镰孢菌对戊唑醇的敏感性测定 6
2.2.2禾谷镰孢菌和亚洲镰孢菌对唑类几种不同杀菌剂敏感性测定7
2.2.3 测定突变菌株（Fg、Fa共15种）对苯醚甲环唑 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
、咪鲜胺、氟环唑、种菌唑、叶菌唑、戊唑醇的EC508
3讨论12
致谢 12
参考文献 13小麦赤霉病菌对三唑类杀菌剂抗药性菌株的生物适合度测定
引言
小麦赤霉病不仅对小麦产量和品质造成严重影响，而且在病原菌在染病籽粒还可产生多种毒素如脱氧雪腐镰菌醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEA）等，严重威胁粮食和食品安全。近年来，受耕作制度改变和气候变化等因素影响，小麦赤霉病在欧洲、北美等小麦主产地区流行频繁，危害程度不断加重[12]；在我国，今年也出现了小麦赤霉病发生区域扩大、流行频率升高、灌浆期病情加重的问题[3]。目前由于缺乏有效的高抗、丰产、优质小麦品种，使用化学药剂仍然是防治赤霉病的重要措施。常用防治赤霉病的杀菌剂有多菌灵、麦角甾醇生物合成抑制剂（EBIs）和氰烯菌酯等。但是由于对化学药剂防治的依赖，以及药剂品种过于单独和重复使用，长期下来，小麦赤霉病菌对部分药剂出现了十分严重的抗药性。本试验所使用的三唑类杀菌剂属于麦角甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂，小麦赤霉病菌对麦角甾醇生物合成抑制剂类的抗药性产生一部分原因是CYP51基因的点突变[7]，在本试验中通过研究小麦赤霉病抗药性菌株的菌丝生长、菌丝干重、致病力测定、CYP51基因的点突变情况等内容来探究该菌株的生物适合度以及抗性机制。
目前，我国已对小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性机理有了比较深入的研究，但对麦角甾醇生物合成抑制剂对小麦赤霉病菌的作用机制缺乏系统的研究报道[46]。近年来，麦角甾醇生物合成抑制剂逐渐取代多菌灵药剂成为防治小麦赤霉病的主要药剂。麦角甾醇生物合成抑制剂不仅能够减少赤霉病的病情，使小麦产量增加，更重要的一点是戊唑醇和羟菌唑还能够减少感染赤霉病的籽粒中毒素的含量[7]。麦角甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂的作用靶标是甾醇14α脱甲基酶，由CYP51基因编码，绝大多数真菌中只有一个基因编码14α脱甲基酶，但小麦赤霉菌基因组中存在三个CYP51同源基因（CYP51A/B/C），这三种基因的敲 除突变体对DMIs类杀菌剂的敏感程度是不同的[8]，因此通过实验研究对比具有CYP51点突变的小麦赤霉菌株在对三唑类药剂抗性上的差异对进一步探索CYP51基因的作用也是有帮助的。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
本试验所用的小麦赤霉病菌菌株（Fusarium graminearium）共49株，分别是实验室敏感菌株2021以及以田间敏感菌株BM6、BM50为出发菌株进行药剂驯化诱导出的49个菌株。
1.1.2 供试药剂
苯醚甲环唑（先正达）
丙硫菌唑（拜耳）
咪鲜胺（先正达）
氟环唑（先正达）
种菌唑（先正达）
叶菌唑（先正达）
戊唑醇（先正达）
1.2 试验方法
1.2.1 小麦赤霉病菌抗药性筛选
1.2.1.1 抗性菌株的药剂驯化
以实验室已有敏感菌株2021和田间敏感菌株BM6、BM50为出发菌株进行药剂驯化诱导。在PDA培养基上生长3 d的菌落边缘打取直径5 mm的菌碟，将菌碟接到含戊唑醇15 ppm的药板上，每板接10个菌碟，各10个板，置于25 ℃培养箱中黑暗培养10 d后，将各菌有角突的菌落转接到15 ppm药板上稳定一代后，将其再转接到较高浓度30 ppm药板上生长37 d，再转接到50 ppm药板上37 d，再转接到更高浓度75 ppm的药板上诱导37 d，经过4代药剂诱导得到49个诱导菌株。
1.2.1.2 抗性菌株的紫外诱导
用高温灭菌的5 mm孔径的打孔器在小麦赤霉病菌株的PDA平板上打孔，用灭菌牙签挑到100 ml的绿豆汤中产饱，25 ℃摇培4 d；用灭过菌的擦镜滤纸过滤收集孢子于2 ml的离心管中，5000 rpm离心5 min，弃上清，用无菌水悬浮混匀底部的孢子，使孢子浓度在105/ml左右；吸取200 μl的该浓度的孢子均匀涂在10 ppm、15 ppm、30 ppm的戊唑醇抗性板上；将该平板放在离紫外光源1020 cm处直接紫外照射45 s；将平板放在25 ℃培养箱中培养35 d，长出的即为抗性突变菌株。

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