腐霉属（Pythium）是茸鞭生物界卵菌门（Oomycete）中的一类重要病原菌，可以危害植物和动物，如多种腐霉可以侵染大豆根部引起根腐病。基于特异分子靶标开发病原菌的分子检测技术，是病害诊断与病情监测预警的重要基础。实验室前期从田间分离到三种危害大豆根部的腐霉菌（刺腐霉、大豆腐霉和土栖腐霉），由于三种腐霉菌亲缘关系较近，使用传统的分子靶标难以开发特异性的分子检测体系，且三种腐霉菌的基因组尚未被测序，因此，本研究对上述腐霉菌进行了转录组测序，随后采用无参考基因组的方式进行组装和分析，旨在比较分析获得的转录本序列以挖掘特异性靶标。转录组测序分别测得刺腐霉9,626,947条clean reads，大豆腐霉11,831,890条clean reads和土栖腐霉12,683,691条clean reads，经Trinity组装后分别得到了32,670、26,931和32,496条转录本序列，通过序列聚类分析最终找到了三种腐霉菌中各只有1个拷贝的直系同源基因1953条，共651组。本文选取了559组具有序列多态性，功能注释相对完善的序列，可成为后续进一步筛选并建立分子检测技术的候选分子靶标。此外，对三种腐霉菌的转录本进行了CDS分析及信号肽预测等功能分析。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 实验材料与方法 2
1.1 测序菌种 2
1.2 提取方法 2
1.3 测序数据获取 2
1.4 数据的清洗 3
1.5 数据的组装 3
1.6 拼装质量分析 3
1.7 功能注释 3
1.8 预测编码蛋白框 3
1.9 信号肽的预测 4
1.10 同源基因的查找 4
2 实验结果与分析 4
2.1 测序序列质量 4
2.2 序列组装质量 5
2.3 基因的功能注释 5
2.4 蛋白编码框预测 6
2.5 同源聚类分析 6
2.6 信号肽预测 6
2.7 靶标位点寻找 7
3 讨论 7
参考 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
文献： 7
基于转录组拼装挖掘三种腐霉菌的特异分子靶标
引言
腐霉属（Pythium）是卵菌（Oomycete）中的一类重要病原菌。并且腐霉属的菌种繁多，目前已知的分类已经超过了150种，在水中，陆地都可以生存[1]。大多数的腐霉菌以腐生为主。腐霉菌会导致多种植物疾病，如导致种子腐烂，叶片受损，根和果实的腐烂，收割后期的腐烂等[2]。腐霉菌可以侵染很多作物，如黄瓜，小麦，玉米，辣椒等，造成根腐病[3]。许多腐霉菌可以通过雨水和灌溉水来传播其游动孢子，进而侵染其他新宿主[4]。这些腐霉菌主要通过气孔和伤口来侵入寄主组织，因为其不能产生足够的压力来穿透完整的寄主表皮细胞。当腐霉菌进入植物体内后，能够迅速杀死植物宿主的细胞，来获取养分[5]。此外，腐霉菌喜高温、高湿的环境，因此更容易在温室培养的作物中大面积发生，造成较大的经济损失。
病原菌的检疫是控制该病害最有效的防治措施，因此需要有较好的方法来快速，准确的鉴定出病原物以保障农业生产的安全。从前由于腐霉菌和其他植物病害造成的病害症状相似，且发病初期的病害症状并不明显，使得其诊断较为困难，通常需要将病原物分离培养和鉴定才能完成诊断。但是不同种的腐霉菌菌丝形态和分生孢子较为相似，腐生种类多，导致其诊断难度较高，且费时费力[6]。今年来随着分子生物学技术的发展和测序技术的成熟，特别是PCR（聚合酶链式反应）技术和相关的分子标记技术的发现与开发，使得分子检测技术已经成为病害诊断的一种重要手段。其中常规PCR和实时定量PCR测定已经得到了较为广泛的应用，目前超过20种腐霉菌都可以通过其检测鉴定[7]。一般植物病原菌的检测会使用转录间隔区（ITS）来作为主要靶标，但是越来越多的实验表明，由于ITS序列在不同物种间非常保守，尤其在腐霉菌中很多菌种之间ITS序列的差异很小，难被以ITS为靶标设计的引物区分开来[8]。因此，发掘新的分子检测靶标对于提高腐霉菌检测的准确度有着重要的意义。
近期大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室从黄淮地区的大豆根腐病样品中分离鉴定的三种腐霉菌，分别是刺腐霉（Pythium spinosum），土栖腐霉（Pythium terrestris）和大豆腐霉（Pythium sojae）。这三种腐霉菌在形态上十分接近，且基于目前在腐霉菌中常用的分子靶标基因，也难以选择特异性序列区段进行引物设计。因此，需要进一步从这些腐霉菌的基因序列中挖掘新的特异性的分子靶标，但由于这三种腐霉菌都没有进行过基因组测序，而基因组测序费用相对高昂，因此本实验使用转录组测序及无参考基因组的拼装策略来获得三种腐霉菌的转录本序列，从中挖掘具有丰富序列多样性的基因。
实验材料与方法
测序菌种
测序的菌种为大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室于2017年从黄淮地区的大豆根腐病样品中分离鉴定的三种腐霉菌，分别是刺腐霉（Pythium spinosum），土栖腐霉（Pythium terrestris）和大豆腐霉（Pythium sojae）。
提取方法
将三种腐霉菌分别转接到V8固体培养基平板上，在25℃黑暗条件下培养3 d后，在其菌落边沿切取10个（2 mm × 2 mm）菌丝块。然后将切取的腐霉菌丝块转移至V8液体培养基，在25℃环境中培养5~7 天。过滤PDB液体后收集菌丝，并经过抽干后液氮冷冻研磨成菌丝粉，存放于20℃的环境中保存。
运用CTAB法取适量菌丝粉，研磨后转移至CTAB提取液（900μL 2%）和SDS（90 μL 10%）的2ml Eppendorf 管中，混合均匀后放在65℃水中加热一小时，其中每10分钟上下颠倒几次。1小时后在12000rpm转速下离心10min。离心后取上清液和等体积的酚、氯仿、异戊醇( 体积比为 25: 24: 1)混合均匀，再次离心10min（12000rpm）。取上清液于新的的1.5 mL Eppendorf 管中，和2倍体积的无水乙醇混合，于20℃的环境下沉淀静置一小时以上。再次离心10min（12000rpm），取沉淀物用70%的乙醇洗涤2次，在室温下晒干。最后用灭菌超纯水或者TE（pH8.0）来溶解沉淀物（在37℃下处理约1小时）。完毕后使用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度，保存于20℃的环境下[9]。
测序数据获取

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561571.html