基于emgfp重组模拟表位的氯噻啉免疫分析方法的建立【字数：8416】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言（或绪论）1
1 1材料与方法2
1.1 材料3
1.2 方法3
1.2.1重组模拟表位载体构建将荧光肽探针基因插入到pET22b（+）载体中3
1.2.2重组模拟表位的制备荧光肽探针的制备4
1.2.3重组模拟表位的活性测定荧光肽探针的活性测定4
1.2.4制备抗体标记的Fe3O4 MNPs制备抗体标记的Fe 3 O 4 MNP 4
1.2.5 MSFIAMSFIA的程序5
1.2.6交叉反应性率(（CR ）) 5
1.2.7 氯噻啉添加回收在加标样品中回收氯噻啉5
1.2.8 HPLC验证 5
2 结果和讨论5
2.1 重组模拟表位的鉴定荧光肽探针的鉴定5
2.2 荧光恢复所需要的培养时间8
2.3 优化甲醇浓度甲醇的最佳浓度9
2.4 MSFIA的灵敏度敏感性 10
2.5 MSFIA的特异性 11
2.6 添加回收 在加标样品中回收氯噻啉 12 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$
2.7 HPLC验证13
3 3结论 154
致谢 154
参考文献 165
基于EmGFP重组模拟表位的氯噻啉免疫分析方法的建立
引言
引言：噬菌体展示多肽技术提供了两种检测小分子的模式：（1）作为模拟表位，可特异性结合抗体，从而建立竞争型免疫检测方法[1，2，3，4]，和（2）作为抗免复合体，可以识别抗原抗体复合体，从而建立非竞争型免疫检测方法[3，5，6，7]。与传统的基于化学合成半抗原作为竞争物相比，噬菌体展示肽易于获得，且通常表现出更好的灵敏度和特异性。然而，它们仍存在一些不可忽视的缺点。噬菌体颗粒较大且流动性较差，不适合建立均相检测和免疫层析方法。且通常需要第二种试剂对噬菌体颗粒进行检测。另一方面，噬菌体的遗传稳定性不强，也不易于长期保存，且存在生物安全隐患。在保留多肽活性的情况下去除噬菌体骨架可以克服这些缺陷。化学合成是生产活性多肽的一种方法，然后再将多肽标记示踪物或载体用于检测[8，9，10，11]。通过生物表达产生活性多肽则是另一种低成本的方法[11，12，13]。
如果采用活性酶或荧光蛋白取代噬菌体骨架被活性酶或荧光蛋白取代，进行检测时则不需要示踪物的标记或通过辅助试剂进行检测。据我们所知目前，只有两篇研究论文关于这种构建模式只有两份报告：（1）GonzálezTechera等人 （2008）将噬菌体展示肽与碱性磷酸酶融合，但是碱性磷酸酶这种构建模式需要数小时才能产生可读信号。；（2）最近，我们的实验室最近将噬菌体展示肽与纳米荧光素酶融合以构建重组嵌合体模拟表位，并开发了生物发光免疫分析方法[14]。 ，与噬菌体酶联免疫吸附分析方法（ELISA）相比，重组嵌合模拟表位体显示出相似的特异性和更好的灵敏度[15]。
绿色荧光蛋白是在荧光蛋白的研究和应用中最受关注的已广泛应用于生物研究。，它具有稳定的荧光信号和较强的抗光漂白性。同时，它不像酶一样需要底物才能产生光信号。在该此次实验中，选择翠绿色荧光蛋白（EmGFP）（一种绿色荧光蛋白的突变体），作为融合蛋白，将把EmGFP与可以特异性识别抗氯噻啉抗体 (mAb 1E7)的氯噻啉的模拟表位环状8氨基酸模拟表位多肽（C215）分别融合于EmGFP融合，即在的N端（C215EmGFP）和C端（EmGFPC215）上连接EmGFP和C215产生新的荧光肽探针，制备重组模拟表位。再用该探针开发磁分离荧光免疫分析（MSFIA）测定氯噻啉，同时采用表面功能化修饰的磁性纳米颗粒（MNPs）作为反应平台和特殊特异性的分离方式。，建立基于磁分离技术的均相荧光免疫分析方法（MSFIA）。重组模拟表位可自动从用解离mAb 1E7上解离，从而解决的荧光肽探针来解决由MNPs的产生的荧光内滤效应（IFE）。）引起的荧光检测的问题。检测不同样品中MSFIA的回收率，并通采用过高效液相色谱法（HPLC）验证MSFIA的准确性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 试剂
anti抗His标签抗体
购自Abcam（Cambridge，UK）
anti抗EmGFP标签抗体
购自Abcam（Cambridge，UK）
pRSET / EmGFP载体
购自Invirtrogen（California，USA）
pET22b（+）载体
购自Novagen（Darmstadt，GER）
BCA蛋白测定试剂盒
购自Pierce（Rockford，IL）
HisTrap HP柱购
购自GEHealthcare（Piscataway，NJ）。
用于Fe 3 O 4 MNP合成和标记的试剂
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561569.html
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