禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病是小麦生产上主要的真菌病害，每年给麦类生产带来严重的损失，严重威胁全世界粮食生产安全。SNARE蛋白在膜与膜之间的融合过程中具有重要作用。实验室前期研究发现SNARE蛋白FgVam7和FgPep12通过参与囊泡运输过程调控禾谷镰孢菌的生长发育、无性繁殖、子囊孢子释放及致病过程力。但是，SNARE蛋白如何调控禾谷镰孢菌子囊孢子释放的机制尚不清楚。实验室前期研究发现，在 ∆FgVam7 和 ∆FgPep12敲除突变体中各种离子含量（包括K+、Na+、Ca2+与Cl-K+、Na+、Ca2+、与Cl-）和醇类含量下降，并在添加不同的离子通道蛋白抑制剂后能够抑制野生型的子囊孢子释放。有研究发现胞内囊泡运输过程中的离子通道蛋白参与调控子囊孢子的释放。因此，本文采用酵母双杂交技术一对一验证胞内囊泡运输过程中离子通道蛋白是否和与FgPep12以及FgVam7的互作关系，发现SNARE蛋白FgPep12、FgVam与FgNeo1(FGSG_05149)蛋白三者两两互作。为了了解FGSG_05149gNeo1蛋白是否与调控禾谷镰孢菌子囊孢子释放有关的作用机制，通过CPR与原生质体转化的方法进行基因沉默并获得∆FgNeo1突变体。对突变体进行表型分析，研究发现∆FgNeo1突变体参与调控禾谷镰孢菌生长发育、子囊孢子释放及致病过程。综上所述，SNARE蛋白FgPep12通过与FgVam7和FgNeo1FGSG_05149相互作用形成复合物来参与调控禾谷镰孢菌子囊孢子的释放过程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1 材料与方法3
1.1试验菌株,载体及培养和保存条件3
1.2 禾谷镰孢菌菌丝体 DNA、RNA的抽提及cDNA的合成3
1.3 酵母双杂交一对一验证 FgPep12和离子通道蛋白的相互作用关系3
1.4 禾谷镰孢菌∆FgNeo1突变体的构建34
1.4.1禾谷镰孢菌∆FgNeo1 沉默载体的构建34
1.4.2 原生质体转化4
1.5 禾谷镰孢菌∆FgNeo1的转化子验证 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
5
1.5.1 快速提取基因组5
1.6 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体的表型分析5
1.6.1 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体在不同培养基上菌丝生长的测定5
1.6.2 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体的产孢量分析和孢子形态观察5
1.6.3 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体有性生殖能力分析5
1.7 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体子囊孢子释放测定5
1.8 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体在小麦胚芽鞘上的致病性测定6
2 结果与分析6
2.1 酵母双杂交一对一验证离子通道蛋白和FgVam7以及FgPep12的互作关系 6
2.2 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体的获得 7
2.3 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体表型分析调控禾谷镰孢菌生长分化及致病力 7
2.3.1 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体菌丝生长减慢8
2.3.2 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体产孢能力下降和孢子形态异常 8
2.3.3 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体有性生殖能力下降 8
2.3.4 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体致病能力丧失 8
2.4 禾谷镰孢菌 ∆FgNeo1 突变体子囊孢子不能正常释放 8
3 讨论9
致谢10
参考文献112
附录A 本研究所使用的引物123
附录B 本研究所使用的培养基145
SNARE蛋白FgPep12调控禾谷镰孢菌子囊孢子释放的分子机制研究
引言
小麦是我国第二大粮食作物，种植面积和产量仅次于水稻[1]。小麦赤霉病、白粉病和纹枯病是长江中下游地区小麦的三大病害，其中小麦赤霉病发生面积最广、流行频率最高[2]。小麦赤霉病俗称麦穗枯、红麦头[3]，是潮湿和半潮湿区域麦类粮食作物真菌流行病害，在全世界30多个国家和地区都有发生，我国小麦生产的主要粮食产区也有发病，造成小麦的产量损失十分严重。最近几年，由于气候的变暖和耕作制度也发生了改变，小麦赤霉病的发病频率就不断地升高，发病面积也有逐年扩大的迹象，小麦赤霉病大面积的爆发给农业生产带来重要的经济损失。据不完全统计，近年来赤霉病的发生面积已经达到全国小麦种植面积的80%， 造成大约五分之一的产量损失。小麦赤霉病发生面积广、流行频率高，不仅可造成小麦产量的损失，被侵染的小麦含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及玉蜀黍赤霉烯酮(ZEA)等毒素，人、畜误食后可致发烧、腹泻、呕吐等症状，怀孕母畜中毒后可引起流产[4]。
赤霉病的病征和病状表现为小花和颖片外表面棕褐色、深紫色到黑色的坏死。紧邻穗花序下方的穗基部可能出现褪绿变褐或者变紫，随后，花序组织通常会枯萎，出现变白和茶色，同时内部的谷粒萎缩，芒通常变得不成型，扭结弯曲向下[5]。穗腐于小麦扬花后出现，最初在颖壳上呈现水渍状褐色斑，渐蔓延至整个小穗，小穗随即失水变为“白穗”[6]。病苗芽鞘变褐色腐烂，根冠也随之腐烂。
由于基因克隆，遗传转化等分子生物学方法与技术的应用，对禾谷镰孢菌功能基因的克隆、鉴定、异源表达及其表达调控等分子生物学研究取得了很大进展[7]。最近几年，利用稳定的遗传转化体系(PEG介导的原生质体转化)获得许多和致病侵染相关的基因突变体。例如囊泡运输相关基因VAM7参与调控禾谷镰孢菌的致病过程[8]。
真核生物中，生物体需要通过胞吞和外泌等生物学过程以维持其正常的生长代谢。胞吞和外泌等生物学过程需要在特定的细胞器(高尔基体、内质网、液泡或者溶酶体等)中，在有序的调控下进行反应。
生物体中，胞外大分子物质等货物蛋白的运输主要靠的是复杂的囊泡运输过程。囊泡运输指的是囊泡以出芽的形式从一种细胞器转移到另一种细胞器的过程，主要伴随着生物体内膜系统的分裂与融合。
囊泡运输在生物体内是非常保守的。有许多蛋白质家族和复合物参与调控囊泡运输过程。首先，胞外的大分子物质(蛋白质和脂质等)被小囊泡包裹后，与受体的膜进行融合形成胞吞囊泡。随后胞吞的小囊泡沿着细胞骨架到达早期内涵体/分选内涵体进行筛选，此后一部分蛋白质会被运输到晚期内涵体，最后到达液泡或者溶酶体进行降解；另外一部分蛋白质(膜受体蛋白质)则直接由早期内涵体返回到细胞膜上，进行下一轮的运输。研究表明 SNARE 蛋白主要在细胞器的膜与膜之间的融合的来调控囊泡运输过程。
SNARE 蛋白是一个大的超蛋白家族，在胞吞和外泌的囊泡运输过程中介导细胞膜的融合过程。根据 SNARE 蛋白在生物体中的亚细胞定位，SNARE蛋白可以分为TSNARE和VSNARE。VSNARE通常在其C端有一个SNARE motif，而 TSNARE 通常会有 2~3 个额外的多肽结构。一个异二聚体 TSNARE 蛋白通常由一条重链和两条轻链组成。突触囊泡上的 SNARE motif 作为其重链，SNAP25 超家族的成员的 SNARE motif 作为其轻链。在细胞膜的融合过程中，VSNARE 和 TSNARE 相互作用导致囊泡与靶标细胞膜结合在一起组成一个转移 SNARE 复合物。在此过程中四个扭曲平行的 SNARE motif 聚集形成四聚体在一起为囊泡和靶标细胞器的融合提供能量。

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