popw互作蛋白的筛选【字数：7065】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.2诱饵载体pGBKT7PopW的构建2
1.2.1.1青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取2
1.2.1.2目的基因的克隆2
1.2.2诱饵载体转化酵母菌株与自毒性和自激活检测4
1.2.3酵母双杂交筛选文库中的PopW互作蛋白5
1.2.4酵母阳性菌落的PCR扩增 5
1.2.5杂交结果的测序和序列分析5
2 结果与分析6
2.1诱饵载体自毒性与自激活检测6
2.2酵母双杂交筛库结果6
2.3杂交结果的测序和序列分析7
3 讨论7
3.1本实验的意义与目标7
3.2本实验的结论与问题7
致谢8
参考文献8
图1 PopW自毒性检测6
图2 PopW自激活检测6
图3 酵母质粒PCR鉴定电泳图7
PopW互作蛋白的筛选
引言
引言：PopW是实验室自主开发的来源于青枯劳尔氏菌(Ralstonia solaanacearum)的一种新型harpin蛋白。当PopW蛋白侵入烟草叶片时,会快速引起组织破裂引发过敏反应,对热稳定,对蛋白酶敏感。PopW蛋白包含由159个氨基酸由N端的Harpin结构组成，207个氨基酸构成果胶酶C端的裂解结构域，N末端的结构域引起过敏反应。但PopW蛋白不是引起致病和过敏反应所必须的。
此外，经过亚细胞定位、质壁分 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^
离、过敏性反应等实验研究发现，PopW是无活性的果胶酶同源物，锚定在植物细胞壁上，其全长及其N末端Harpin结构域都可以引起过敏反应（hypersensitive response），通过三型泌出系统分泌到胞外[1]。
PopW的原核表达可诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性,促进烟草生长。,提高烟草品质，提高中优烟草的比例[2]。田间试验表明,POPW蛋白处理能提高番茄、水稻和黄瓜的抗病能力,促进辣椒开花进程,提高黄瓜光合色素的含量,促进黄瓜生长。提高黄瓜产量,增加各种营养物质含量,从而提高黄瓜品质[35]。
针对上述研究结果可以显示PopW作为一种激发子，在诱导植物抗病性中发挥着重要的作用，但其作用机理研究的还不是很透彻，因此研究PopW蛋白的作用机制，找到与其相互作用的蛋白至关重要，不仅能够从分子的角度进一步解析PopW蛋白的作用机理，同时也为促成PopW蛋白实用化打下坚实的理论根基。
几乎全部细胞进程都有蛋白质互作介入。筛选蛋白质互作的手段有很多种，而时至今日，研究蛋白质相互作用最经典的手段则是酵母双杂交系统。该系统的功能是通过在营养缺乏介质上生长或呈现颜色反应来检测的。如果将DNA文库直接克隆到捕获载体上,并在基因组范围内筛选已知的诱饵蛋白,可以筛选大量的与诱饵蛋白相互作用的蛋白质[6]。此次试验就是运用的经典的酵母双杂交系统筛选基因组库中能与PopW蛋白产生互作的基因片段。
1 材料与方法
1.1材料
1.2方法
1.2.1诱饵载体pGBKT7PopW的构建
1.2.1.1青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取
具体方法如下：
1)将15 ml菌液注入离心管中，置于离心机中以10000 rpm离心1分钟，尽可能吸净上清液。
2)将200 μl缓冲溶液GA注入细菌沉淀中，振荡成细菌悬浮液。
3)将20 μl 蛋白酶K溶液注入离心管中，振荡均匀。
4)将200 μl缓冲溶液GB注入离心管中，振荡15秒，70 ℃水浴10分钟，溶液应变清澈。离心5至6秒，以去除帽内壁上的液滴以去除帽内壁上的液滴。
5)将220 μl无水酒精注入离心管中，震荡数秒，期间絮凝沉淀的出现乃正常现象。 最后离心数秒以去除帽内壁上的液滴。
6)将从第5步得到的溶液和絮凝颗粒一同用移液枪注入到一个吸附柱CB3中，置于离心机中离心30秒，转速为12000 rpm。倒尽废液，将吸附柱CB3放置在收集管中。
7)将500 μl缓冲液GD注入吸附柱CB3中，置于离心机中离心30 秒，转速为12000 rpm。倒尽废液，将吸附柱CB3放置在收集管中。
8)将600 μl漂白液PW注入吸附柱CB3中，置于离心机中离心30秒，转速为12000 rpm。倒尽废液，将吸附柱CB3放置在收集管中。
9)重复操作步骤8。
10)将吸附柱回收至收集管中，置于离心机中离心2分钟，转速为12000rpm。弃置废液，最后放置在室温中5~6min使离心管中的冲洗液干燥。
11)将吸附柱置入一个新的离心管中，往吸附膜的中央悬空滴加50200 μl的TE洗脱缓冲液，于室温中放置5至6分钟。置于离心机中离心2分钟转速为12000 rpm，最后将溶液用移液枪吸起回收到离心管中。
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561547.html
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