稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)会使水稻产生稻瘟病，而稻瘟病是水稻上的毁灭性病害之一，稻瘟病造成水稻产量大幅度降低，严重威胁全球粮食生产安全。在病菌的侵染过程中，蛋白磷酸酶调控的去磷酸化过程调控病菌的分化与侵染，在酿酒酵母中发现，蛋白磷酸酶Yvh1和核糖体成熟关系密切。但其在稻瘟病菌生长发育及致病中的作用机制仍有待解析，前期研究发现蛋白磷酸酶MoYvh1均匀分布在整个细胞中。在与水稻互作时，胞质中的MoYvh1进入细胞核控制核糖体合成，从而调控病菌胞外蛋白合成。本研究进一步鉴定病菌中受MoYvh1调控的胞外蛋白并鉴定其在病菌侵染阶段的生物学功能。研究通过收集野生型以及MoYVH1缺失突变体附着胞阶段的胞外液，与突变体的孢子共注射水稻叶鞘细胞后发现，野生型附着胞产生的胞外液互补突变体的侵染缺陷，表明胞外蛋白存在抑制寄主活性氧的活性物质。进一步通过质谱鉴定其中差异胞外蛋白。本研究进一步提取互作阶段寄主植物的胞间蛋白，为解析稻瘟病菌侵染阶段分泌质外体效应子寄主防卫反应的分子作用机制提供参考。研究结果对深入了解稻瘟病菌的致病分子机制及开发新型农药提供潜在靶标具有重要的理论指导意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法.....6
1.1.1供试的菌株和培养基6
1.1.2酵母菌株及培养条件6
1.2 方法..6
1.2.1敲除载体的制备............6
1.2.2稻瘟病菌的原生质体转化6
1.2.3目的基因片段和载体的酵母转化7
1.2.4 酵母菌落质粒的大肠杆菌转化...........8
1.2.5提取胞外蛋白的步骤 ..........................8
1.2.6 互作阶段外泌蛋白质的获取...............9
1.2.7突变体的菌落形态和营养生长测定....9
1.2.8突变体的产孢测定........................9
1.2.9致病性测定....................... *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
.................................................................................................9
2 结果与分析.9
2.1 MoYvh1控制稻瘟病菌胞外蛋白的合成抑制寄主防卫反应.......................9
2.2鉴定受MoYvh1调控的胞外蛋白及其功能预测............11
3 讨论...12
致谢...........12
参考文献...13Moyvh1调控的稻瘟病菌胞外蛋白的鉴定及功能分析
引言
在真核细胞中，蛋白质的磷酸化和去磷酸化参与基因调控、信号传导以及细胞周期过程(Zolnierowicz & Bollen, 2000)。长期以来，人们普遍关注激酶的功能及蛋白质的磷酸化过程，对其生物学功能及其分子调控机制进行了一系列研究，而对将蛋白质去磷酸化的磷酸酶研究较少。近年来一些学者对蛋白质去磷酸化的探索性研究中，发现磷酸酶在生物体中也具有重要的功能，磷酸酶与激酶一样在细胞信号网络的调控中发挥着不可或缺的作用。激酶通常控制信号反应的激活，而磷酸酶被认为控制信号传导的速度及持续性，两类酶的功能相辅相成(Tonks, 2006)。传统意义上的蛋白磷酸酶家族主要分为三类：水解磷酸酪氨酸残基的酪氨酸蛋白磷酸酶、水解丝氨酸/苏氨酸残基的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、识别并水解这两类残基的双特异性蛋白磷酸酶(DSPs)(Keyse, 1995)。在酿酒酵母中，多个蛋白磷酸酶的功能得到解析，发现其主要通过去磷酸化作用参与信号传导、有性生殖和胁迫应答(Zolnierowicz & Bollen, 2000)。而在丝状真菌中磷酸酶的功能及其调控机制鲜有报道，仅在构巢曲霉中发现蛋白磷酸酶参与有丝分裂过程(Son & Osmani, 2009)；在小麦赤霉病菌中发现蛋白磷酸酶参与调控病菌的生长发育及致病过程(Yun等, 2015)，但是在上述报道中，磷酸酶去磷酸化的分子调控机制并不清楚。
在前期的研究中发现，稻瘟病菌蛋白磷酸酶MoYvh1调控病菌生长分化与致病力。进一步研究发现其可以在两个热激蛋白MoSsb1和MoSsz1的帮助下应答胞外氧化胁迫进入细胞核。在细胞核中MoYvh1通过与核糖体成熟因子MoMrt4竞争性结合核糖体前体控制核糖体的成熟过程。进一步研究发现，MoYvh1可以通过调控核糖体的成熟，控制胞外蛋白的加工进而促进稻瘟病菌抑制寄主活性氧压力，实现成功侵染。
在酿酒酵母中，蛋白磷酸酶Yvh1和核糖体成熟关系密切。在核糖体成熟前期，核糖体反转蛋白Mrt4与核糖体结合后，对核糖体进行修饰。核糖体成熟后期，细胞核内的Yvh1与核糖体结合，导致Mrt4和核糖体分离，并滞留于细胞核内，而Yvh1伴随核糖体出核，完成核糖体的最终成熟(Kemmler等, 2009; Lo等, 2009)。在酵母中Yvh1缺失突变导致Mrt4和核糖体不能正常分离，致使核糖体不能正常成熟(Beeser & Cooper, 2000)。但是Yvh1是在酵母中如何入核尚未见报道，且在丝状真菌中Yvh1和Mrt4的关系及其生物学功能也尚未见报道。基于酿酒酵母和实验室前期的研究基础，我们提出如下科学假说：正常状态下，核糖体成熟后期稻瘟病菌细胞核中的MoYvh1竞争性地占据MoMrt4与核糖体结合的位点，使MoMrt4与核糖体解离，MoYvh1帮助核糖体成熟。稻瘟病菌在活性氧胁迫及其与寄主互作时，胞质中MoYvh1进入细胞核，更多地占据MoMrt4与核糖体结合的位点，加速核糖体的成熟，这样病菌可合成更多(新)蛋白去应答外界活性氧胁迫及完成其致病过程。
稻瘟病菌分泌大量效应蛋白进入寄主细胞内或质外体空间帮助病菌成功侵染(Khang et al., 2010; Qi et al., 2016; Li et al., 2017)，与此同时，寄主植物也进化出可以识别病菌效应蛋白的免疫机制来抵御病原菌的进一步侵染(Dangl and Jones, 2001; Martin et al., 2003; McDowell and Simon, 2006; Liu et al., 2014)。小分子的植物激素包括茉莉酸、水杨素、油菜甾醇等在发挥这类免疫功能是具有重要的作用(Pozo et al., 2004; Loake and Grant, 2007; Pieterse et al., 2009)。我们之前的研究鉴定到蛋白磷酸酶MoYvh1调控病菌清除寄主侵染位点周围的活性氧积累调控病菌致病力(Liu et al., 2016)，因此我们推测(Moyvh1突变体无法清除活性氧的原因是因为缺少了野生型菌株所包含的可以用以抑制寄主免疫反应清除活性氧的活性物质，包括胞外效应蛋白。那么是什么导致了(Moyvh1突变体中缺失胞外液中重要的作用成分？结合酵母中的研究结果Rpp0作为核糖体60S亚基最终成熟的调控蛋白参与核糖体柄的形成(Kemmler et al., 2009; Lo et al., 2009)，而在本章的研究中，我们发现MoYVH1的缺失导致MoRpp0无法正常的结合在核糖体上，进而证实了(Moyvh1突变体中存在核糖体缺陷。在侵染早期，病菌分泌效应蛋白以抑制寄主防卫反应，一旦核糖体出现缺陷，那么大量原本应该正常加工合成的蛋白质无法通过核糖体装配进而运输处细胞，这种缺陷也就导致了(Moyvh1突变体的致病缺陷。

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