本研究以纹枯病菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染拟南芥野生型和ago1-27、ago2-1突变体植株，探究了合适的侵染条件和发病情况，以每棵拟南芥距根1cm处正对放置带菌小米4处，每处1粒处理，则可较大程度上保证拟南芥2天后发病且重复间一致。对比野生型与突变体发病差异，推测相较于野生型，ago1-27突变体对立枯丝核菌菌核侵染有更强的抗性，而ago2-1突变体更加敏感。通过免疫沉淀反应得到Argonaute蛋白与sRNA结合的复合物，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹法对蛋白表达进行了验证。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1实验材料与设备 2
1.1.1拟南芥材料 2
1.1.2病原菌 2
1.1.3设备 2
1.1.4 PDA培养基 2
1.1.5分离胶 2
1.1.6浓缩胶 2
1.1.7 IP extracting buffer 2
1.1.8 IP washing buffer 2
1.2实验方法 2
1.2.1菌核培养 3
1.2.2撒种育苗 3
1.2.3移苗培养 3
1.2.4放置菌核 3
1.2.5组织取样 3
1.2.6蛋白提取 3
1.2.7制作聚丙烯酰胺凝胶 3
1.2.8 SDSPAGE 3
1.2.9 Western Blot 3
2结果与分析 3
2.1表型结果及分析 3
2.2 免疫沉淀结果及分析 4
2.3实验条件结果及分析 4
3结论与讨论 4
致谢 6
参考文献 6
Argonautes蛋白结合小分子RNA在植物抗纹枯病中作用的
初步研究
引言
引言
本研究致力于为探究植物抵抗纹枯病菌的机制提供可能的思路，并为相似 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
实验设计下其他实验提供方法上的借鉴和细节处理上的提醒。
水稻纹枯病在世界范围内广泛分布，是水稻三大病害之一 [1]。该病害可在水稻的整个生育期发生，主要对叶片及叶鞘造成损害，影响大、流行性较强、寄主范围广泛，并且其病原菌菌核能忍耐不良环境，防治困难，对我国稻区尤其是南方稻区造成了严重的危害[2]。现在我国水稻纹枯病的发生面积约占我国水稻种植总面积40%以上，一般产量损失在10%30%，发病高时减产50%，严重时减产70%，最高可为毁灭性的[3]。
现我国主要依赖农药防治稻纹枯病，虽然简便并且效果迅速，但长期大范围使用单一药剂导致病原菌抗药性增强，防治效果已逐渐降低，而剂量加大后对环境造成危害，导致恶性循环[2]。所以水稻纹枯病的防治，已经成为一个急需解决的问题。
目前，分子植物病理学广泛应用于研究植物抗病机制。Argonautes (AGOs)是生物中存在较为普遍的一类相对保守的蛋白。RNA介导的沉默复合体（RISC）是RNA干扰机制中作用于靶标mRNA的重要复合体，而AGO蛋白（Argonaute proteins）是组成RISC的核心蛋白之一。AGO蛋白结合小分子RNAs（sRNA)并在其靶标mRNA位点上介导基因沉默[4]。因此，AGO蛋白成为RNA干扰研究中的热点。对靶标mRNA的剪切需要sRNA介导，sRNA是一组大小在2124 nt的非编码RNA，通过沉默复合体对靶标mRNA来调节转录或者转录后水平的基因表达。mRNA与sRNA通过碱基配对特异性识别，在两者结合过程中，sRNA被固定在AGO蛋白的两个结构域。通过免疫沉淀技术可以获得AGO蛋白，并获得与之结合的sRNA。
水稻纹枯病菌侵染水稻后会引起水稻相应的抗病机制，拟南芥作为模式植物，对水稻纹枯病菌同样呈现感病症状。本研究以纹枯病菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染拟南芥野生型和ago127、ago21突变体植株，对比野生型与突变体发病差异，并通过免疫沉淀反应（IP）得到Argonaute（AGO）蛋白与sRNA结合的复合物，并且从复合物中回收sRNA，构建cDNA文库进行高通量测序，分析sRNA信息，进一步研究其在抵抗纹枯病菌中的作用。本实验直接目的在个体水平上探究AGO1、AGO2蛋白的功能，确定表型差异；为构建相关小RNA文库提供材料基础。本实验要解决的关键问题是：掌握菌核接种、免疫沉淀、蛋白质电泳及蛋白印迹法操作流程和注意事项；探究出立枯丝核菌在拟南芥上合适的接种量和发病时间。本实验预期获得拟南芥抵抗水稻纹枯病作用机制中与AGO1、AGO2蛋白相结合的sRNA文库，本实验拟在重复实验中不断优化实验条件。
本研究是关于Argonautes蛋白结合小分子RNA在植物抗纹枯病中作用的初步研究，符合小分子RNA研究应用于植物抗病性研究的一般思路。本研究实验材料为模式生物拟南芥，具有多方面的便利性。关于立枯丝核菌侵染拟南芥的条件的研究并未广泛报道，本研究中对侵染条件的实验可提供经验。本研究实验对象为拟南芥植株，相较于离体侵染实验，包含更多的实验影响因素。前期同实验室所做的纹枯病菌立枯丝核菌对拟南芥叶片离体侵染的实验发现ago21突变体植株相对于WT植株更为感病，而ago127相对于WT植株更为抗病，推测与AGO1结合的sRNA和与AGO2结合的sRNA在拟南芥抵抗水稻纹枯病菌的抗性机制中起着不同的作用。有研究指出，突变体ago127中的AGO1虽保有切割活性，但是植株叶片发育异常，推测miRNA不仅通过切割起作用，而且可能通过其他方式调控靶基因表达[5]。对AGO蛋白结合的小分子RNA的测序分析，可以探究sRNA对拟南芥发病及抗病的响应，发现被显著诱导或抑制表达的sRNA，对深入理解植物免疫机制以及通过RNA沉默增强植物抗病性发面具有重要意义。
1材料与方法
1.1实验材料与设备
1.1.1拟南芥材料：WT、ago21、ago127
1.1.2病原菌：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）

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