植物AP2/ERF类转录因子在植物体中具有多种生物学功能，对植物生长发育、抵抗环境胁迫、提高抗病性等方面发挥重要的调控作用。前期研究发现，在蜡质芽胞杆菌AR156诱导番茄植株提高对南方根结线虫抗性的过程中，AP2/ERF类转录因子的表达量显著上升。转录因子通常由一个 DNA 结合功能域(Binding Domain , BD)及一个或多个其他调控蛋白相互作用的转录激活功能域(Activation Domain ,AD)组成，本研究使用酵母单杂交系统对AP2/ERF类转录因子ERF4、ERF1a的转录激活区域进行活性验证，并在大肠杆菌中构建起原核表达系统，为后期深入探究该类转录因子对植物抗病性的调控机理打下基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
供试菌株、载体2
1.2方法 2
1.2.1酵母单杂交技术验证AP2/ERF类转录因子转录激活区域活性2
1.2.1.1酵母单杂交技术原理3
1.2.1.2 AP2/ERF类转录因子编码基因的克隆3
1.2.1.3 构建重组载体3
1.2.1.4 酵母感受态细胞的制备3
1.2.1.5 酵母感受态细胞的转化3
1.2.1.6 半乳糖苷酶活性检测法鉴定阳性单克隆4
1.2.2 原核表达系统构建4
1.2.2.1构建原核表达载体4
1.2.2.2 原核表达蛋白的提取4
1.2.3 原核表达蛋白的纯化4
1.2.4 SDSPAGE蛋白电泳4
1.2.5 考马斯亮蓝染色5
2 结果与分析5
2.1 AP2/ERF类转录因子LeERF4、LeERF1a具有转录激活活性5
2.1.1 获得AP2/ERF类转录因子编码克隆基因5
2.1.2 成功构建AP2/ERF类转录因子重组质粒 5
2.1.3 AP2/ERF类转录因子激活功能域具有转录激活活性6
2.1.3.1  *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
载体质粒转化成功能够正常表达6
2.1.3.2 验证为阳性克隆7
2.2 通过原核表达系统成功获得目的转录因子7
2.2.1 获得AP2/ERF类转录因子编码克隆基因7
2.2.2 完成AP2/ERF类转录因子原核表达载体构建8
2.2.3 原核表达系统功能正常能够表达出目的蛋白AP2/ERF类转录因子8
3 讨论9
致谢9
参考文献10
AP2/ERF类转录因子克隆、转录激活域活性分析及原核表达系统建立
引言
转录因子（transcriptional factor，TF），又称为反式作用因子（transacting factor），是一种位于细胞核内的蛋白质分子。转录因子可以与启动子区域内的顺式作用元件进行特异性相互作用进而激活或者抑制基因转录，在特定的时间与空间以特定的强度进行表达[1]。在植物体的生长发育等生理活动中，植物转录因子能够发挥重要的调控作用，并且参与调节植物体次生代谢及抗逆反应过程。因含有由60~70个氨基酸组成的AP2/ERF 结构域而得名AP2/ERF 家族，几乎存在于所有植物中。该类转录因子参与多种生物学过程，如植物生长调节，花、果实、种子发育，生物及非生物胁迫响应等[2]。
此前有研究发现，AP2/ERF家族转录因子在提高植物抗病性方面发挥重要作用，如：Lee等研究发现，在烟草中过量表达烟草Tsil1基因或辣椒CaERFLP1基因能够显著提升植株对细菌性斑点病抗病性[3]。2004年，Fischer等发现烟草NtERF5过量表达使其对烟草花叶病毒的抗病性提高[4]。据Chen等报道，在水稻和烟草中过量表达番茄OPBP1基因能够增强对烟草疫病、水稻稻瘟病及纹枯病的抗性[5]。Chakravarthy等研究发现，番茄Pti4基因在拟南芥中过量表达可显著提高植株对白粉病及细菌性斑点病的抗病能力[6]。2010年，Pan等发现过量表达番茄SlERF3 ∆RD能够促进PR基因（如PR1、PR2和PR5）的表达, 同时显著提高对青枯病的抗病能力[7]。Lai等2013~2014的报道称，通过在烟草中分别过量表达大白菜BrERF1和辣椒CaERF5，烟草对青枯病的抗性均显著提高，且BrERF1及CaERF5主要通过水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、乙烯（ethylene，ETH）途径介导抗病基因表达[8~9]。AP2/ERF家族转录因子近些年来的研究深入，但其在调控植物抗性中的作用机理尚不清晰。
蜡质芽胞杆菌AR156是由本人实习所在实验室从土壤中分离获得的专利菌株，对青枯病、疫病、根结线虫病、枯萎病等土传病害都有着很好的防效[10]，在前期研究中，对蜡质芽胞杆菌 AR156 预处理番茄并接种根结线虫过程中的不同时间点进行取样，结果显示AR156 处理能够显著提升番茄中 AP2/ERF 类转录因子ERF4、ERF1a的表达，通过转录组学分析成功从蜡质芽胞杆菌 AR156 处理的番茄叶片中克隆得到对应的 AP2/ERF 类转录因子编码基因LeERF4、LeERF1a。
本实验在前期研究基础上，利用酵母单杂技术对AP2/ERF类转录因子ERF4、ERF1a转录激活区域进行活性分析，并在大肠杆菌中建立转录因子原核表达系统，为后续转录因子ERF4、ERF1a的转录调控元件功能分析打下基础，未来可应用于研究AP2/ERF类转录因子协同调控番茄对根结线虫抗性过程中的作用机理，作为植物病害生物防治的科学依据之一，为蜡质芽胞杆菌AR156的实际应用提供理论基础。
1 材料与方法
1．1材料
供试菌株、载体
本研究采用酵母菌株AH109（酵母单杂交系统常用标准菌株）、E.coli DH5α（用于质粒的保存）、E.coli Rosetta（用于重组质粒的原核表达），菌株与50%灭菌甘油以1:1的比例混匀，在70℃环境下长期保存；重组质粒pEG103::LeERF4、pEG103::LeERF1a（用于目的基因克隆）、质粒pET28a+、质粒pGBKT7存于大肠杆菌E.coli DH5α中。
1．2方法
1.2.1酵母单杂交技术验证AP2/ERF类转录因子转录激活区域活性

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