长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸，无蛋白编码能力或则编码能力极低的RNA转录本。但随着生物信息学、转录组、蛋白质组学等多组学技术的发展，传统的非编码RNA不编码蛋白的观点受到挑战。近年来，人们逐渐发现lncRNA中存在一些小的开放阅读框（small open reading frame，sORF），其可以编码短肽，并在生物体内发挥重要的功能。本实验通过前期筛选及表型重复，确定了一个与生长相关的lncRNA，并命名为H30。在对H30的功能机制探究中，发现筛选得到的H30具有一段500bp的高表达、高保守的区域。结合近年来植物生长与多肽激素密切相关及lncRNA编码潜能的报道，本研究拟利用筛选得到的H30的编码能力作为进一步功能探究的切入点。在本次实验中，我采用了sORF筛选、烟草瞬时转化等多个实验来推测验证H30的编码潜能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1 VIGS实验 3 1.2.2 棉花cDNA的提取5
1.2.3 生物信息学分析5
1.2.4 编码能力分析5
1.2.5 启动子的克隆及验证6
2 结果与分析6
2.1 lncRNA的筛选6
2.2 lncRNA H30的生物信息学分析8
2.2.1 lncRNA的基因结构及表达量分析8
2.2.2 H30的编码能力分析11
2.3 sORF在烟草中的瞬时转化12
2.4启动子的克隆及验证14
3 讨论 17
致谢19
参考文献19
附件1 引物设计表21
附件2 植株数据统计表21
棉花中长链非编码RNA H30的功能和编码能力的探究
引言
中国是世界上第一大棉花生产和消费国，棉花及其防治工业共同组成的工农产业链对于中国的国民经济发展具有重要意 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
义。但由于我国的棉花研究及生产体系仍处于发展阶段，所以我国的棉花产量及其纤维质量相比于美国而言，在国际市场仍不具备优势。因此，在分子水平上进行棉花生长发育的研究，会给提高国产棉花质量、促进纺织工业的发展带来巨大的可能[1]。
lncRNA是一类长度大于200个核苷酸，无蛋白编码能力或者编码能力极低的RNA转录本。随着高通量测序技术的深入发展与广泛应用，越来越多的研究表明，lncRNA在真核生物中广泛存在，并具有重要的生物学功能。在动物研究中，人们发现lncRNA参与基因组印记、X染色体失活等生物学过程[2]。同时也有研究证明，多种疾病与lncRNA的异常表达或者突变相关[3]。在植物中也发现存在大量lncRNA，并参与在植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等各个过程[4]。同时，随着生物信息学、转录组学和蛋白质组学等多种综合技术的发展，传统的非编码RNA不编码蛋白的观点逐渐受到挑战。近年来，人们开始发现lncRNA中也存在着一些特殊的小开放阅读框（small open reading frame，sORF），其可以编码短肽，并在生物体内发挥重要的功能[57]。
传统的开放阅读框（ORF，open reading frame）常被定义为一段以起始密码子开头，以终止密码子结尾的核苷酸链。可转录出mRNA并翻译成蛋白的ORF常被称为编码DNA序列（coding DNA sequence，CDS）。sORF常常根据其大小而区分于ORF，但并非所有的sORF都会转录并编码出短肽。短肽一般由mRNA或者非编码RNA上的sORF区域翻译而成，其长度多数在100个氨基酸以下[8]。目前发现的最短的短肽仅仅含有6个氨基酸残基[9]。该短肽由编码S腺苷甲硫氨酸脱羧酶(Sadenosylmethionine decarboxylase ，SAMDC)基因的上游ORF（upstream open reading frame，uORF）翻译而来。其可以通过与多胺结合，从而使核糖体滞留在uORF上，进而抑制下游基因的翻译,降低SAMDC的表达水平, 从而调节人类的多胺合成[10]。在植物中也有同源的SAMDC基因和类似的机制来调节多胺合成，但短肽为52个氨基酸，且uORF区域与人类并没有同源序列[11]。
在真核生物中最早的短肽研究可以追溯到大约20年前。在1996年，德国马普植物育种研究所的研究人员们发现豆科植物的早期结瘤素（early nodulin 40, ENOD40）的转录本可以翻译产生一个10氨基酸的短肽[12]。值得注意的是，这个基因早先一直被认为只能转录产生长链的非编码RNA而发挥功能。随后，研究人员们在大豆中更加详细地研究了这个基因，发现它包含有两个sORF，且这两个sORF确实可以编码短肽，一个编码12个氨基酸的短肽，另一个编码24氨基酸，且这两个短肽会与一种蔗糖合成酶相互作用[13]。随后，研究人员们不断在植物中鉴定到了许多短肽。例如，在拟南芥中，人们鉴定到了一个来自于POLARIS（PLS）基因的36肽[14]。其会通过影响乙烯信号[15]来调节根生长以及叶片维管束形成。其他还包括Brick，Zm401p10,Zm908p11等[16]都进一步证明了短肽在调节植物形态建成和信号通路方面的重要性。现在短肽的研究已经逐步地扩展到了其他的物种，包括病毒、微生物、酵母和动物等等。得益于第二代测序以及生物信息学的发展，目前关于短肽的研究也已经扩展到了全基因组水平上。重要的是，研究人员也发现，鉴定得到大部分短肽都来自于lncRNA[16]。并且，随着多组学技术的发展，研究人员们也鉴定到了很多具有重大功能的能够编码短肽的lncRNA。
例如，最近有研究人员利用信息分析手段预测已知的lncRNA分子可能编码的多肽，然后通过质谱确定这些推测的多肽是否表达。这项研究成功鉴定到了一个在人和小鼠中保守的，且在各个组织中大量表达的lncRNA（LINC00961）[17]。这个lncRNA包含有一个sORF,且能够翻译成一个90氨基酸的短肽。他们将其命名为SPAR（small peptide of amino acid response）。这个SPAR定位在晚期内体和溶酶体中。分子与生化实验表明， LINC00961 编码的这个短肽在mTORC1蛋白复合物活性调控方面扮演了重要角色。后者是细胞内的一个关键营养感应因子，调控了多个细胞进程，比如翻译、代谢、细胞生长和增殖，改变其功能会导致癌症等疾病的发生。也有研究发现，一些lncRNA翻译出来的短肽能够正向或者负向地调节钙离子泵（SERCA）的活动。在70年代初，用生物化学方法在哺乳动物的肌肉细胞发现了一个52个氨基酸的短肽（Phospholamba，PLN）[18]。PLN是一种跨膜α螺旋结构，和SERCA结构的凹槽配对，有利于减少钙摄取的构象状态。在哺乳动物还鉴定出来另一个相关的31个氨基酸的短肽sarcolipin（SLN）[19]，也显示出类似结合并抑制SERCA的作用。在果蝇中，研究人员们也发现了lncRNA pncr003:2L可以编码两个相近的短肽 （Sarcolamban，SCL）[20]。这两个短肽可以与SERCA在果蝇中的直系同源蛋白CaP60A结合[21]，同样发挥调节钙离子泵的作用。突变体果蝇显示了在肌肉功能方面包括心律失常的严重缺陷。最近的研究确定了一个在小鼠和人类骨骼肌中特定表达的46氨基酸的短肽myoregulin（MLN）[22]，也可以与SERCA结合。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561165.html