6-甲基腺嘌呤(m6A，N6-methyladenosine)是真核生物中普遍存在的具有甲基化修饰的核苷。在模式植物拟南芥中，m6A甲基转移酶METTL3的同源蛋白为MTA，METTL14的同源蛋白为MTB，使MTA、MTB基因失活会导致m6A甲基化形成的缺陷及胚胎发育异常，表明了其在植物发育中的重要作用[1]。LEC1是植物胚发育过程中一个重要的调控因子，能够活化胚胎发生和胚分化过程一些必需基因的表达[2]。本研究旨在利用胚胎拯救启动子pLEC1得到植株的目标基因纯合体，以便进行后续相关基因、甲基转移酶以及m6A修饰有关的研究工作。mRNA是关联DNA和蛋白质的核心分子，参与了遗传信息的传递，具有重要的遗传意义。6-甲基腺嘌呤(m6A，N6-methyladenosine)是真核生物中普遍存在的具有甲基化修饰的核苷。本文综述了表观遗传学、mRNA与m6A的修饰；阐述了拟南芥m6A修饰中主要的甲基转移酶的作用；介绍了胚发育过程中重要的调控基因LEC1的意义。最后，本文对RNA修饰的深入研究进行了展望。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1实验材料5
1.1.2主要试剂5
1.1.3主要仪器5
1.2实验方法 5
1.2.1拟南芥突变体的鉴定与筛选5
1.2.2载体构建与转化6
2结果与分析8
2.1拟南芥突变体筛选和鉴定的结果与分析8
2.2载体构建与转化的结果与分析9
2.2.1 PCR扩增目的基因片段9
2.2.2重组质粒的连接10
2.3 拟南芥侵染转化的结果与分析10
2.3.1拟南芥的侵染10
2.3.2 转基因阳性植株的筛选11
3讨论 11
致谢12
参考文献12
附录14
拟南芥N6methyladenosine修饰中甲基转移酶的研究
引言
m6A是高等生物mRNA中含量最为丰 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
富的修饰之一，在进化上较为保守[12]。1995年，Dunn等在细菌DNA中首次发现了m6A的存在，随后在一些其他菌株和噬菌体中也检测到了m6A的微量存在[13]。1974年，Desrosiers等[14]借助真核生物中poly(A)结构的发现研究了Novikoff肝癌细胞中mRNA的甲基化情况，发现在哺乳动物细胞mRNA中也存在m6A，之后逐渐发现m6A是自然界中广泛存在的一种RNA修饰形式，在很多种真核生物细胞中都能检测到m6A的存在，包括哺乳动物[15]、果蝇[16]、酵母细胞[17]、小麦[18]、燕麦[4]、玉米[19]及核内复制的病毒[20]等。
5mC可以通过硫酸氢盐盐处理的方法进行检测，但mRNA的m6A修饰并不影响WatsonCrick碱基配对的原则，也不受目前已知的化学衍生反应影响，故传统的基于反向转录的方法不适用于m6A的测定。近年来，将二代测序技术和抗体关联进行结合，开展了m6A位点的转录组学测序。结果发现，m6A的形成具有一定的序列特异性和偏好性，mRNA中平均每2000个核苷酸上就存在一个m6A修饰[2122]，平均每条mRNA上含35个m6A，多发生于RRm6ACH序列上(R=A/G(G>A)H=U/C/A(U>A>C))[23]。RRACH大约每85nt出现一个，平均每条mRNA有约30个这样的序列。在细胞内mRNA上m6A占所有腺苷酸的0.10.4%[24]。2012年，Dominissini等[21]借助了其实验室开发的m6Aseq技术，在人和鼠的转录组水平分别揭示了m6A修饰的分布，他们发现在人的mRNA上有超过12000个m6A修饰位点，主要分布于长外显子内和终止密码子附近，且人与鼠之间修饰位点的分布高度保守。Meyer等[22]利用MeRIPseq技术在7676个哺乳类基因的mRNA上发现了m6A修饰，修饰位点主要集中于3UTR区域和终止密码子附近。同年，Bodi等[25]发现，拟南芥的m6A修饰多分布于3端的poly(A)尾上游100~150nt范围内。2014年，Li等[26]发现，水稻愈伤组织与叶子中分别有8138和14253个基因的mRNA含有m6A修饰，且这些m6A修饰主要分布于翻译起始和终止位点附近。通过m6AIP与高通量测序结合研究发现，多数基因的m6A修饰倾向于分布在mRNA的蛋白质编码序列(CDS)、3非翻译区(3UTR)、终止密码子附近、剪切位点附近以及长的外显子区域；在microRNA靶位点及其邻近区域也有m6A富集[27]。此外，m6A在转录本上的临近区域相对集中分布，不具随机性。
不同基因mRNA上m6A水平存在差异，m6A可能会影响靶基因mRNA的稳定性、剪接加工、翻译和microRNA的加工，具有序列特异性、甲基化位点选择性及修饰水平动态性特征。m6A受甲基转移酶(METTL3，METTL14等)、去甲基化酶(FTO，ALKBH5等)和一些RNA结合蛋白(YTHDF1/2/3，ELAVL1等)共同调控，在细胞内动态可逆[28]。m6A与干细胞命运、生物节律相关。Batista等[29]的研究发现，m6A可促进干细胞从自我更新特异分裂状态向细胞分化状态进行转化。2015年，Geula等[30]研究m6A修饰对胚胎干细胞的多能性调控作用结果表明，m6A可以利用促多能性基因mRNA水平和稳定性的改变，对胚胎干细胞的多能性进行调控。Fustin等[31]发现m6A修饰和生物节律相关，研究人员在许多与生物钟的相关基因转录本上发现了这一修饰，将METTL3进行沉默以抑制这些修饰，将会导致生物钟的延长和RNA加工的延迟。
将与m6A相关的酶组分敲除或抑制会产生重要的表型变化，如拟南芥的胚胎滞育、哺乳动物的细胞凋亡、酵母配子的发育缺陷等。m6A修饰对植物的生长发育尤为重要。2008年，Zhong等[32]发现，若拟南芥缺失m6A修饰，将会引发胚胎致死的表型出现。2012年，Bodi等[25]发现，在缺少m6A修饰的拟南芥植株中，与物质运输有关的基因表达水平被下调，与应激反应有关的基因表达水平则有所上调；降低m6A修饰水平将削弱顶端优势并引起花器官缺陷。m6A修饰的基因具有组织特异性表达的特性。Luo等[33]发现，拟南芥中mRNA的m6A修饰不同于哺乳动物，非常保守，多在起始密码子、终止密码子和3UTR区分布。
二、METTL3、METTL14甲基转移酶的作用

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