油菜细胞质pcr鉴定方法初步研究(附件)【字数：5349】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 实验方法3
1.2.1 油菜基因组DNA的提取3
1.2.2 油菜线粒体DNA的提取3
1.2.3 油菜特异性片段的PCR扩增3
2 结果与分析4
2.1 油菜基因组DNA提取物电泳结果分析4
2.2 油菜线粒体DNA提取物电泳结果分析5
3 讨论5
致谢6
参考文献7
附录8
油菜细胞质PCR鉴定方法初步研究
引言
引言
油菜杂交种的细胞质存在多种类型。日本学者ogura[1]在萝卜中发现的一种天然雄性不育类型（ogura CMS）。Thompson [2]以波兰春油菜品种Bronowski作为父本与冬油菜品种RD58作为母本杂交的F2代中，发现细胞质雄性不育，进一步培育成Tcms。Shiga和Baba[3]在以日本甘蓝型油菜品种Chisayanatane为母本，Hokuriku 23为父本的杂交后代中发现细胞质雄性不育，进一步培育成Scms。后研究发现[4]，TCMS与SCMS属同一类型，合称nap型。傅廷栋等[5]于1972年春在甘蓝型油菜品种波里马中，发现了polCMS。1976年湖南省农科院[6]利用这一波里马不育材料首先实现pol C *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072&
MS三系配套。此后，中国学者发现了多种细胞质雄性不育材料，如MI CMS[7]、ABI CMS[8]、153A CMS以及NCa CMS[9]等。
油菜细胞质的差别与细胞质中线粒体和叶绿体DNA序列差异有关。决定细胞质雄性不育的基因基本上都存在与线粒体基因组上。线粒体基因组研究取得了重要进展。目前，线粒体cam、ole、nap、pol、jun、car的基因组也已测序完成[10]，其线粒体基因组大小分别为219747 bp，360271 bp，38662 bp 、38742 bp 、219766 bp，232241 bp。所含有的功能基因基本相同，但是所含的不育基因是不同的，而且基因组结构有所不同，各自含有一些未知功能蛋白基因。nap和pol线粒体类型中发现的雄性不育基因分别为orf222和orf224 [11]。
油菜遗传育种和杂交种生产中，需要鉴定细胞质的类型。基于基因组序列研究表明，叶绿体基因组差别不大，而线粒体基因组差别较大，因此主要可以通过线粒体基因组的特异序列鉴定细胞质类型。
总结起来，细胞质类型的鉴定方法主要包括：
（1）线粒体基因组测序：主要包括传统的DNA测序方法，如Sanger提出的双脱氧测定法、逐步克隆测定法和基因组鸟枪法等；新一代DNA测序方法，如循环芯片测序法、Solexa测序法和焦磷酸测序法等 [12]，但上述线粒体基因组测序的方法过程复杂，成本过高，不易掌握；
（2）恢保关系鉴定方法：取各种来源不同的植株作为测交父本，同时取其上花粉对待测的植株进行测交，至第二年收获测交一代并将其播种，在测交一代的各个生长阶段进行观察，于开花期调查其育性，将所观察的育性情况进行记录，与育性分级标准比对后确定测交一代育性，从而确定细胞质类型[13]。本方法可以准确有效鉴定细胞质类型，但是鉴定恢保关系耗时过长，且成本过高，不易采用 ；
（3）标记鉴定方法：通过以线粒体基因上的特异序列，设计引物，通过PCR方法，理论上可以鉴别细胞质类型。
本研究尝试采用PCR鉴定方法，鉴定细胞质。通过提取油菜DNA，依据不同细胞质mtDNA的特异序列，设计引物，采用PCR方法扩增DNA片段，从而鉴定细胞质类型，研究通过PCR方法鉴定细胞质类型的方法。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本实验的材料取自大学油菜遗传育种实验室,名称见表1。
本实验所用的仪器包括光照培养箱、低温冷冻离心机Eppendorf、恒温水浴锅、20℃冰箱来自大学油菜遗传育种实验室;容量离心机、高速离心机、超速离心机来自大学作物遗传与种质创新国家重点实验室。
本实验所用的试剂有DNase I购自于Roche;蛋白酶K和RNase A购于sigma公司；其它试剂购自于生兴有限公司。
1．2 实验方法
1．2．1 油菜基因组DNA的提取
将不同材料分别于组培间23℃条件下土壤培养3周,每种材料取5株幼苗混
合提取DNA，本实验采用改良的CTAB法提取油菜基因组DNA[20][21]，具体步骤入附录1所示。
表1 实验材料名称
Table 1 Names of experimental materials
材料名称
细胞质分类
J49421
Nap型细胞质
J49431
白菜型细胞质
J49441
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/560676.html
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