小麦白粉病是由专性寄生真菌小麦白粉病菌引起的病害，目前对白粉病抗病性强，抗谱范围广的基因Pm21已被本实验室定位到染色体6VS的FL:0.45-FL:0.58区段 ，在该区段加密遗传标记缩短了Pm21所在的区间，并在该区段克隆获得一个CC-NBS-LRR类的抗病基因NLR1-V，但是该候选基因在小麦的抗白粉病通路中如何发挥作用，如何通过蛋白质间相互作用发挥抗病机制目前尚不明确，本研究利用酵母双杂交系统技术在实验室前人研究的基础上，对定位于Pm21基因座的CC-NBS-LRR类抗白粉病候选基因NLR1-V的蛋白在小麦抗白粉病通路中与哪些基因蛋白有互作进行研究，构建诱饵载体和三框cDNA文库，通过三轮筛选得到35个可能互作的基因片段，分析蛋白类型和结构为之后NLR1-V基因介导的抗白粉病分子机制奠定基础、提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
技术路线3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1酵母AH109菌株3
1.1.2载体3
1.1.3酵母双杂文库4
1.1.4缺陷培养基4
1.1.5 Carrier DNA（鲑鱼精）4
1.1.6 XαGal4
1.2方法（技术路线）4
1.2.1诱饵载体和酵母双杂文库的构建 4
1.2.2小规模转化酵母菌AH109(单转)5
1.2.3诱饵蛋白自激活报告蛋白基因检测5
1.2.4文库质粒大规模转化已携带钓饵质粒的酵母（双转）5
1.2.5四缺培养基蓝白斑筛选5
1.2.6 CC结构域筛库测序比对分析结果5
2结果与分析6
2.1 诱饵载体和库质粒的构建6
2.1.1诱饵载体的构建 6
2.1.2酵母双杂文库的构建 6
2.2小规模转化酵母菌AH109(单转)以及自激活验证7
2.3文库质粒大规模转化已携带钓饵质粒的酵母（双转）8
2.4四缺培养基蓝白斑筛选8
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
2.5四缺培养基上蓝色候选菌落菌液PCR扩增测序8
2.6 CC结构域测序比对分析结果8
3讨论9
致谢10
参考文献10
利用酵母双杂交技术筛选NLR1V的互作蛋白
农学134班 曹姝琪
引言
引言：小麦，全球种植最为广泛的农作物之一，为世界性重要粮食作物，人们喜爱的食物如面条、面包、吐司等食物都是由小麦面粉加工而成。生育期长是小麦重要的特征之一，由于生育期长，小麦自播种至收获整个过程中受到各种生物及非生物逆境胁迫的可能性就会加大，其中小麦白粉病是由专性寄生的白粉真菌引起的一类主要病害，小麦受白粉菌侵染后植株营养供应白粉菌生长，正常生长时的养分被掠夺，光合作用效率下降，光合产物积累不足植物生长发育就会减缓进而影响一系列生理反应，最终造成植物分蘖减少、幼苗死亡，使穗数、穗粒数、千粒重下降，最终大幅度减[1]。对于小麦的白粉病的防治任重道远，可以通过一些合理的栽培措施或者喷施药剂等方法进行防治，然而最经济有效的防治方法是种植抗病品种，抗病品种中由于抗病基因发挥作用而使作物抗病，著名的“基因对基因”这一假说就阐述了植物抗病基因与病原物无毒基因互作时植物发生过敏性反应的原理[2]，即在病原物的侵入点进行定位快速死亡[3]，也就是让植物具有了对病原物产生了抗性[1, 4, 5]，但是由于白粉菌生理小种会不断发生变异，这些变异可能会导致已有抗性基因不起作用，品种抗性的丧失，所以不断的发掘新的抗性基因，选育抗性强，范围广的抗白粉病品种则显得尤为重要与迫切。
植物抗病基因中NBSLRR是一大类抗病基因，根据抗病基因序列特点和结构主要分为五大类[6]：NBSLRR (nucleotide binding site plus leucine rich repeat) 类 、LRRTM (leucinerich repeat plus transmembrane receptor)类、STK (serinethreonine kinase)类、RLK (recepetor like kinase)类和 SACC (signal anchor plus coiledcoil)类，其中NBSLRR类抗病基因又可分为两种亚类为TNL（TirNBSLRR）和CNL(nonTirNBSLRR or CCNBSLRR)两个亚家族，目前发现的大多数单子叶植物的NLR基因都属于CNL类，且前人研究证实了单子叶植物中尚未发现CNL类基因[79]。本研究所研究的基因NLR1V即为CNL类抗白粉病病基因，该类抗病基因编码蛋白主要含有三个结构域Tir(Tollinterleukin1 receptor domain)、CC(coiledcoil)结构域、NBS(nucleotidebinding site)结构域以及LRR(leucinerich repeat)结构域。CC 结构是许多蛋白的功能域，包括结构蛋白、驱动蛋白和转录因子，已有研究证明该结构域在蛋白质间的相互作用中起重要作用[1, 3, 10]；NBS结构域，核酸结合位点，因为该结构域比较保守，同样也是三个结域中最保守的部分，也常常被广泛地用作植物抗病基因识别和分类的标志，约 300 个氨基酸；LRR即为富亮氨酸重复，该结构域和其他两个结构域相比保守性较低，但也有研究发现LRR具有识别病原菌的作用[11]，通过酵母双杂交技术证实了LRR结构参与了蛋白之间的识别[12, 13]。
本实验室前期利用分子标记将Pm21定位到6VS的FL:0.45FL:0.58区段[14]，并将细胞遗传学与分子遗传学的方法相结合，克隆得到Pm21基因座的关键候选基因S/tpkV[15]目前实验室根据新鉴定出的6VS小片段易位材料加密该区间的分子标记，缩短了Pm21所在区间，并对目标区段中的NLR类基因进行挖掘，在抗病材料T6VS6AL和其感病突变体中克隆得到基因NLR1V，对该基因进行序列比对分析，同时构建载体对其功能进行分析。那么，该基因蛋白在小麦抗白粉病的抗病通路中与哪些基因蛋白相互作用以及如何通过互作发挥抗病机制的呢？所以，本研究对NLR1V基因蛋白在小麦抗病通路中与哪些蛋白有互作进行初步筛选，获得候选基因，为之后探索该基因介导的抗病机制提供依据。
目前存在很多种研究蛋白质互作的方法，为蛋白研究领域提供了很多平台，有：融合蛋白 pulldown 实验、亲和印迹、免疫共沉淀、蛋白探针筛选、噬菌体展示、荧光共振能量转移、酵母双杂技术、双分子荧光互补技术等[16]，以上技术均有巧妙的原理。例如融合蛋白 pulldown 实验，该技术将目的蛋白与种标签蛋白以融合蛋白的形式表达，然后将融合蛋白在不同标签蛋白的色谱柱上纯化，最后得到诱饵蛋白，因此诱饵蛋白也被固定在含有相应基质的色谱柱上，将细胞抽提物通过色谱柱后，如果蛋白能够与诱饵蛋白发生相互作用，那么发生作用的蛋白很可能被吸附保留下来，没有发生作用的蛋白就会洗脱液洗脱掉，由此得到了与目的蛋白互作的蛋白；亲和印记又可称为western印记检测，类似于DNA的southern杂交，将聚丙烯酰胺凝胶上分离好的样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影，但该技术的缺点是实验在细胞外进行，可靠性不高；荧光共振能量转移技术则是将两种目的蛋白分别与两种可以转移能量的蛋白融合表达，在一种荧光的激发下看是否可以激发另一种荧光则可以初步鉴定这两种蛋白是否可以互相作用。

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