小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schw.）侵染引起的小麦病害，严重影响了我国长江中下游小麦的产量与品质，目前生产上所用的抗源主要是望水白和苏麦3号及其衍生系。TaJRL29是植物凝集素蛋白家族的成员，该家族基因在植物防御反应过程中具有重要作用。本研究以望水白为研究材料，利用大麦条纹花叶病毒（Barely stripe mosic virus，BSMV）诱导TaJRL29基因沉默（Virus-Induced Gene Silencing，VIGS）。结果表明，TaJRL29沉默后的望水白与对照材料相比，对赤霉菌更加敏感，推测TaJRL29可能与小麦的赤霉病抗性相关。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 试验材料 3
1．1．1 植物材料 4
1．1．2 溶液及培养基的配制 4
1．2 试验方法 4
1．2．1 RNA的提取与反转录 4
1．2．2 植物基因组DNA的提取 4
1．2．3 大肠杆菌DH5α感受态的制备 5
1．2．4 热激法转化大肠杆菌感受态 5
1．2．5 普通少量质粒的提取 5
1．2．6 高浓度大量质粒的提取 5
1．2．7 目的基因片段的获取 5
1．2．8 PCR产物的纯化 5
1．2．9 载体的构建 6
1．2．10 载体的线性化 6
1．2．11 线性化模板的纯化 6
1．2．12 体外转录及涂抹 7
1．2．13 病毒涂抹 7
1．3 BSMV处理植株的病原菌接种与调查 7
2 结果与分析 7
2．1 BSMV重组载体的构建与体外转录 7
2．2 TaJRL29沉默后对望水白赤霉病抗性的影响 8
3 讨论 8
致谢 10
参考文献 11
利用VI *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
GS方法分析TaJRL29与小麦赤霉病抗性关系
引言
小麦(Triticum aestivum)是世界上最重要的粮食作物之一，但在小麦的整个生育时期，各种病害严重威胁着小麦的产量与品质。在众多的小麦病害中，7080%由真菌引起，不仅直接造成作物产量与品质下降，而且其次生代谢产物也严重威胁着人畜的安全[1]。小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是世界温暖潮湿和半潮湿地区发生的一种毁灭性病害，在我国长江中下游、华南冬麦区和东北春麦区尤为严重，黄河流域及其他地区也偶有发生。但近年来，其发病面积不断扩大，病情趋于严重。小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦真菌病害，在小麦的各生育时期都能发生，造成苗枯、茎基腐烂和穗枯，甚至引起苗腐、茎基腐和穗腐，在我国尤其以穗腐的危害最为严重。小麦赤霉病不仅造成严重的减产和品质降低，感染赤霉菌的小麦籽粒中还会积累大量以单端孢霉烯族毒素（trichothecene）为主的毒素，对人畜有很大的危害[2]，如产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）能引起发热、呕吐、腹泻等中毒现象，还具有致癌、致畸和诱变等作用，严重的甚至导致死亡。因此，挖掘赤霉病抗性基因，并深入研究其抗病作用分子机制，对小麦抗赤霉病育种尤为重要。
植物凝集素是一类非酶和非免疫起源的糖特异结合蛋白[3]，能与多糖结合或使细胞凝集，广泛存在于小麦、大豆（Glycine max [Linn.] Merr.）、花生（Arachis hypogaea Linn.）等植物中并在植物防御反应中起着重要作用，能抑制多种病原菌的菌丝生长和孢子萌发。先前已发现，水稻(Oryza sativa)胚中存在的凝集素能使稻瘟病病菌孢子凝集成团，甚至破裂[21]。目前，根据其蛋白结构特点，将已发现的1000多种植物凝集素划分为16个家族[4]。Jacalin类凝集素(jacalinrelated lectins，JRLs)是近年来发现的一个植物凝集素超家族的新家族。根据生物信息学分析，很多植物中都发现了JRLs，如水稻[4]，拟南芥(Arabidopsis thaliana)[5]，小麦[6]等。Xiang等[7]克隆了TaJRL1基因，并发现其通过影响茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水杨酸（Salicylic acid，SA）信号途径来参与小麦抗病反应。从水葫芦(Eichhornia crassipes)中克隆到的一个Jacalin相关基因EcJRL1可提高对低硫条件的耐受力[8]。Xing等[9]证明VER2是小麦春化诱导必须的一个JRL基因。由此可见，JRLs在植物的抗病、抗逆等反应及生长发育中具有重要作用。
病毒诱导的基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）技术是一种由RNA介导的、通过病毒载体携带一段靶基因序列侵染植物，使得同源基因沉默与表型变异，从而快速分析基因功能的反向遗传学方法。外源基因的导入，会使得植物体内与之同源性极高的內源基因的转录受阻，从而导致基因沉默，这是一种转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）现象，最早发现于植物中[22, 23]。随后发现，真菌和动物中均存在此现象，分别称基因消除（quelling）[24]和RNA干涉（RNA interference，RNAi）[25]。目前，植物中特异性地沉默或敲除靶基因的表达的PTGS方法已有多种，病毒诱导的基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）就是其中之一[26]。VIGS是由Kammen等[27]最先提出，用于描述寄主植物受病毒侵染后具有恢复正常的能力，其机理与RNAi的机制有很多相似之处。当携带有靶基因片段的病毒载体侵染植物后，由于病毒自身的复制机制所致，通常会首先形成双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA）；dsRNA在细胞中被与RAaseⅢ家族相似的特异性核酸内切酶（Dicer酶）切割成21~24nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；siRNAs在植物细胞内通过依赖RNA的RNA聚合酶1（RNAdependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2或RDR6进一步扩增，并以单链形式与Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC），RISC特异地与细胞质中的同源mRNA互作，使同源mRNA降解，从而发生PTGS；此外，RISC可被引导到细胞核，导致核内的同源DNA甲基化等，从而影响基因表达，发生转录水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）[2830]。与传统的基因敲除、转基因等方法相比，VIGS具有短周期、低成本、高通量等优势[10]。目前，VIGS已经成功应用于50多个物种[11]的相关基因功能鉴定，并有望在未来扩大其应用范围。

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