摘要:基于本实验室茶树品种迎霜的转录组数据，通过PCR方法从迎霜的DNA中克隆得到CsDREB-A4基因。分析显示，该基因含开放阅读框长708 bp，编码235个氨基酸，含有AP2/ERF家族转录因子典型的保守AP2结合域，并且与大豆、番茄、葡萄、拟南芥等的DREB转录因子有高度同源性。从进化树方面进行预测与分析，结果表明，该转录因子属于AP2/ERF家族中的DREB亚族的A4组.利用实时荧光定量PCR分析表明，在迎霜茶树品种中CsDREB-A4基因均受高温、低温诱导表达。[1]
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
引言 3
1材料与方法 4
1.1实验材料 4
1.1.1 植物试材 4
1.1.2 DNA、RNA提取及cDNA的合成 4
1.1.3 茶树CsDREBA4基因的克隆 4
1.2实验步骤 4
1.2.1 RNA的提取 4
1.2.2总RNA的纯化及检测 5
1.2.3反转录 5
1.2.4引物设计与合成 6
1.2.5 PCR（Polymerase Chain Reaction） 6
1.2.6 pMD18T Vector连接 6
1.2.7 大肠杆菌感受态DH5α的制备 7
1.2.8大肠杆菌感受态DH5α的转化 7
1.2.9 转化结果的检测与测序分析 7
2 结果与分析 8
2.1 茶树CsDREBA4基因的克隆 8
2.2 茶树CsDREBA4转录因子的进化分析 8
3讨论 10
致谢 10
参考文献 10
茶树DREB转录因子的克隆与分析
引言
茶树是一种喜温暖气候的木本常绿植物，冻害不但严重影响茶叶的产量和质量，同时也制约着茶树的地理分布，所以茶树的抗寒研究向来是茶树科研工作者工作的重点。目前茶树中已经发现的与抗寒调控途径有关的基因很少，只有CBF1、ICE1[31]、RAV[17]
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、ERF[25]、CsCOR[32]5 个。[24]本研究利用RTPCR方法，从茶树品种迎霜的DNA中克隆得到DREB转录因子基因CsDREBA4。对该转录因子进行了进化分析以期为进一步研究茶树温度胁迫响应机理提供一定的参考。[57]
在自然条件下,植物生长周期中会遇到多种生物胁迫,高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫是影响和限制植物生长的重因子,甚至可能会导致栽培物的死亡,以至于影响到了农林业生产收益。所以,非生物胁迫响应的相关基因研究有着重要现实和理论意义.[2]作为基因上游的调控因子的转录因子,在植物的抗逆性中起着重要作用,是启发多种胁迫相关的调控与其功能基因的表达,且在增强植物抗逆性方面比其他单一功能基因更加有效。[56]
现今,植物研究中的与抗逆相关的转录因子主要有AP2/ERF、MYB、bZIP、WRKY和NAC五大类。[11]其中AP2/ERF类转录因子是胁迫相关类转录因子中的一大类,由其结构特点又分AP2、DREB、ERF、RAV和其他等五类亚家族。DREB (Dehydration responsiveelement binding)类转录因子是AP2/ERF家族中与干旱、高温、低温等逆境胁迫相关的植物特有的一类转录因子。因此,DREB类转录因子的研究受到广泛的关注。[79]
茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)山茶科山茶属多年生常绿木本植物，在我国已有几千年的人工栽培历史，是重要的农业经济作物。我国茶区分布较广，地理范围在18°~38°N，94°~122°E内，地跨6个气候带，即中亚带、边缘热带、南亚热带、中亚热带、北亚热带和暖日温带；地形分布复杂，包括平原、丘陵、山地和高原。[10]茶树在这样差异较大地理与气候中，容易受到低温、高温、干旱、强光、盐碱、微生物、虫害等非生物和生物胁迫的伤害，而这些都严重影响着茶叶的产量和品质。[1215]
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 植物试材
‘迎霜’（C. sinensis cv.‘Yingshuang’）二年生扦插幼苗。总RNA的提取采用Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒提取。实验过程中使用的全部塑料制品均经0.1% DEPC水浸泡过夜，灭菌后烘干密闭保存，玻璃制品于烘箱内180 °C干热灭菌3 h。
1.1.2 DNA、RNA提取及cDNA的合成
采用CTAB方法提取迎霜品种茶树幼嫩叶片的DNA。根据Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒说明书提取RNA，用微量紫外检测仪NanoDrop测定提取的RNA样品浓度，用12 gL1变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。然后利用Prime Script RT reagent Kit（大连TaKaRa公司）试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。
1.1.3 茶树CsDREBA4基因的克隆
基于本实验室迎霜品种茶树转录组数据，拼接得到1个茶树DREB转录因子基因的序列，该序列没有内含子。设计1对引物，ZJR91：5ATGAGCTTTGAACTTCAAAATTC3，ZJR92：5TTAATTCCACAACAAAGACTC3，以迎霜叶片DNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：ddH2O 11.9 μL、10×ExTaq Buffer 2 μL、dNTP Mixture（2.5 mmolL1）1.6 μL、MgCl2（25 mmolL1）1.2 μL、Primer1 1 μL、Primer2 1 μL、Template 1 μL、ExTaq（5 unitsμL1）0.3 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。将PCR产物分离、回收后，连接到pMD18T载体上，转化至大肠杆菌DH5α，进行质粒酶切、鉴定、测序。序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.2实验步骤
1.2.1 RNA的提取
准确称取0.1 g叶片组织，将叶片在液氮中磨碎。加入1 mL细胞裂解液，待研钵中液体澄清后转入1.5 mL离心管中。
将离心管中加入300µL去蛋白液和200µL自备氯仿在振荡器上振荡30s混匀。
4 °C，12000 rpm离心510 min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
加入等体积漂洗液，充分颠倒混匀。然后将混合液转入离心吸附柱中，12000 rpm 室温离心1 min。

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