原位杂交（in situ hybridization, ISH）是指将经过被放射性或非放射性物质标记后的目标DNA或RNA序列与变性的染色体DNA进行杂交，然后通过细胞学制片的手段观察目标序列在染色体上分布特征的技术。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是上世纪80年代末期从原位杂交技术发展而来的，是在探针标记过程中，利用荧光标记物如地高辛，荧光素或生物素等非放射性标记物代替传统的放射性同位素而进行的原位杂交。基于重复序列开发的单链寡核苷酸（single strand oligonucleotide, SSON）探针具有经济、简单、高效的优点，在生物染色体的研究中得到越来越多的运用。本实验以栽培菊花单倍体（1n=3x=27）为研究对象，以其有丝分裂中期的根尖为材料进行染色体制片，通过荧光原位杂交技术筛选出了一些可以区分栽培菊花单倍体部分染色体的寡核苷酸探针，可有效地区分栽培菊花单倍体的部分染色体,同时将会对栽培菊花的起源进化具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1根尖有丝分裂细胞制片4
1.2.2寡核苷酸探针设计4
1.2.3 FISH杂交程序和图像获取分析4
2 结果与分析5
2.1 FISH分析5
3 讨论7
致谢7
参考文献8
基于寡核苷酸探针套的菊花单倍体分析
引言
引言
原位杂交（in situ hybridization, ISH）是一种将经过放射性或非放射性物质标记后的目标DNA或RNA探针与变性的染色体DNA杂交，然后通过细胞学定位目标序列在染色体上的分布特征的技术,主要用于对DNA重复序列和多拷贝基因家族的图谱构建[1]，其主要优点为能检测到单拷贝序列且灵敏度高[2]，但也存在着检测方法复杂、分辨率低的缺点[3]。而上世纪80年代由原位杂交技术发展而来的荧光原位杂交（Fluorescence in *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
situ hybridization, FISH）是指在探针标记过程中，利用非放射性标记物如荧光素、生物素等代替同位素与大分子结合的原位杂交技术，荧光原位杂交在引入植物基因组研究后，已被广泛应用于植物染色体的识别。目前已发展的有以基因组为探针的 FISH（Genomic in situ hybridization, GISH）、以基因组BAC克隆作为探针的BACFISH、以RNA作为探针的RNAFISH和以寡核苷酸作为探针的（Single strand oligonucleotide fluorescence in situ hybridization, SSONFISH）等。
以基因组为探针的 FISH（Genomic in situ hybridization, GISH）技术是由FISH技术发展未来的，现已成为植物分子细胞遗传学的重要研究手段，推动了经典细胞遗传向分子细胞遗传的转变[4]。它是利用物种的全基因组 DNA 代替短的DNA或RNA片段作为探针进行外源染色体身份的鉴定，是检测特定物种染色体的重要方法[5]。
菊花（Chrysanthemum morifolium）作为起源于中国的世界第二大产值花卉，因其染色体组成及其供体尚不明确，导致其菊花基因定位和染色体工程育种等工作受到限制，有关菊花染色体区分及序列位置的文章尚未见报道[6]。已故院士陈俊愉[7]长期从事菊花起源研究，他认为如今千变万化的菊花为高度人工远缘杂交起源的 “杂种复合体”，其主要亲本为毛华菊（C.vestitum）、野菊（C. indicum）、紫花野菊（C.zawadskii）和甘菊（C.lavandulifolium）等菊属（Chrysanthemum）植物，经过长期天然杂交和千余年的人工杂交选育形成的。戴思兰[8]运用数量分类学方法对中国菊属（Chrysanthemum）植物进行了基于数量分类的系统进化与亲缘关系研究，发现毛华菊与菊花亲缘关系最近，野菊次之，紫花野菊较远。陈发棣[9]对原产中国的几种野生菊之间的种间杂种进行了减数分裂期染色体的配对行为观察，认为野菊处于异源四倍体阶段，假定为AABB，二倍体材料菊花脑（C.nankinense）和甘菊染色体组相近，均有可能是其供体种，毛华菊是异源六倍体，其染色体组构成应为AABBCC，南京野菊或其近缘种是毛华菊两个染色体组的供体，且毛华菊极有可能是由某个野菊和其他二倍体野生种杂交而成，但其ABC 染色体组的二倍体供体种是哪些，菊属究竟有几个染色体组，他们在菊属植物起源和进化过程中的作用和历程依旧有待明确。王文奎[10]采用菊花脑、野菊和毛华菊三个菊属基因组作为探针进行原位杂交（GISH）时发现，即使在大量封阻DNA的基础上，在栽培菊花的靶染色体上也无特异均匀分布杂交信号的产生。Abd ElTwab等[11]使用GISH手段进行比较基因组分析，发现无法将龙脑菊（C. boreale）、紫花野菊、野菊和小红菊（C.chanetii）等分开，说明这些菊属植物染色体组之间有较近的亲缘关系，即在长期进化过程中发生了互相渗透，可能出现了不同基因组之间趋同和互相混合现象。其实整个菊属大多数种的生长区域经常会有种间的重叠，不排除部分种存在天然杂交后代的产生，人工种间杂交的结实也表示部分菊属种之间并没有严格的生殖隔离。
利用基因组BAC克隆为探针来进行的FISH(BACFISH)是目前常用的另一种方法。除去Cot1 DNA和rRNA等常见用于荧光标记的重复序列，植物基因组中还含有由大量重复序列构成的重复序列家族，这些序列在基因组间存在的拷贝数，长度上的明显差异，直接表现为原位杂交后染色体带型的区别[1213]。Choi[14]对人参（Panax ginseng）基因组3个富含重复序列的BAC克隆进行测序，通过序列分析，发现3个BAC克隆中含有34个长末端重复反转录转座子元件和11个衍生物，分属5个家族，这5个家族覆盖了人参基因组的的1/3。进一步结合FISH技术，对挖掘的特异重复元件进行直观的分析，提供了基因组异源四倍体可视化证据。揭示了人参基因组进化和种间亲缘。Bertioli 等[15]用27个A. duranensis BAC克隆作为探针的FISH研究发现，利用相对较少的LTR 反转录转座子和其节段性拷贝或单LTRs检测出在花生基因组中有相当大比例的高度重复序列元件。
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH），是分子生物学和细胞遗传学的结合，是分析祖先基因组来源，理清种间进化关系，分析染色体组组成的重要手段[1619]。其原理是将特异的DNA探针进行荧光标记后与细胞核内的DNA靶序列杂交，DNA序列间（探针和靶DNA）的同源性越高，结合的就越充分，直观的反映就是杂交信号的强弱和探针在靶标染色体上覆盖范围，能够在细胞水平提供准确且直观的分子证据。这也为研究菊属植物染色体特征、菊花与菊属野生种染色体组间相互关系提供了新思路。在属间亲缘关系研究中发现，亚菊属的疏齿亚菊（A. remotipinna）可不通过幼胚拯救获得与菊属小红菊属间远缘杂种，对这些杂种F1进行荧光原位杂交时，需高浓度的封堵DNA才能区分两亲本染色体组，说明菊属与亚菊属植物亲缘关系较近[20]。相反，菊属与菊属与小滨菊属、Nipponanthemum、菊蒿属的亲缘关系较远，荧光原位杂交分析时不需要封阻DNA就能轻易地将两亲本染色体组区分开，表明两亲本染色体组的亲缘关系较远[21]。植物基因组中大量存在的重复序列，有的相当保守，以其作为荧光原位杂交技术的特异探针，可以提供相对宏基因组探针更为精确的信息[22]。例如rRNA基因常以随机重复的方式排列于一条或几条染色体的特殊位置区域，呈簇状分布，且在不同类型的基因组中拷贝数和染色体上的位置具有特征性[23]。Qi等[24]在三个二倍体种菊花脑、异色菊和甘菊中各发现了2 个5S rDNA 信号和8 个45S rDNA 信号，但位置不全相同。王文奎[25]采用1826s rDNA为探针，发现栽培菊花品种的信号染色体占全部染色体数的比值与毛华菊的十分接近，推测毛华菊在现代栽培菊花起源中起重要作用，同时其它物种也可能参与到了栽培菊花的形成过程中。

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