本课题通过切取苹果枝枯病病组织制片，在显微镜下察看是否出现喷菌现象，对有喷菌现象的浸出液进行平板划线分离培养，之后挑选疑似菌落进行纯化培养，通过烟草过敏反应、致病性测定、Biolog测定以及分子生物学检测等方法分离鉴定苹果枝枯病菌。结果显示，供试材料有苹果枝枯病发病的典型症状，从48份材料中分离保存了17个菌株，其形态学特征与苹果枝枯病病菌一致，并且分子水平的鉴定也证明其为苹果枝枯病的病原菌。实验后续也将进行病菌基因组的测序，以对比新疆不同地区苹果枝枯病病原菌间的亲缘关系。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 3
1.1.1供试材料3
1.1.2实验试剂3
1.1.3仪器和设备4
1.1.4其他实验器材及用品4
1.2实验方法 4
1.2.1培养基的配制4
1.2.2供试材料的分离纯化及形态学鉴定4
1.2.3烟草过敏反应5
1.2.4致病性测定5
1.2.5Biolog测定5
1.2.6ITS区域测序5
1.2.7菌株DNA的提取及特异性引物鉴定5
1.2.8病原菌保存6
1.2.9待测序菌株活化6
2结果与分析7
2.1供试材料发病症状7
2.2病原菌的分离7
2.2.1显微镜检测7
2.2.2形态学鉴定8
2.3病原菌的鉴定8
2.3.1烟草过敏反应及致病性测定8
2.3.2Biolog测定9
2.3.3ITS序列测定10
2.3.4特异性引物PCR检测10
3讨论10
致谢11
参考文献11
新疆苹果枝枯病病原菌的分离和鉴定
引言
2016年6月，在新疆维吾尔自治区伊犁州苹果和梨及其他蔷薇科树木上发现一种新的、危害性极大的病害。发病标样经大学植物检疫实验室鉴定，为我国未 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
曾报到的一种极其危险的细菌病害，应国家各部委保密之要求，经商榷，该病害暂时被称为“苹果枝枯病”。
苹果枝枯病是一种在苹果树和梨树中极易传播且具有毁灭性的细菌性病害，同时也是我国禁止进境的危险性病害之一。病原菌主要危害蔷薇科果树，使得受害部位丧失功能，严重影响果树的产量与质量。现如今随着世界经济一体化的发展，并且各国之间扩大经济贸易，商业、人员等往来更加密切，病菌随蔬果交易、苗木运输等人为因素向世界其它地域传播，这使得当地的生物多样性和经济发展遭受与日俱增的威胁，这在世界范围内将引起重大损失。
苹果枝枯病病菌的寄主范围很广超过130种，主要侵染蔷薇科植物，病菌为害寄主植物后会使植物变黑枯萎如同火烧一般，会造成花的凋谢和死亡，芽、嫩枝、叶和果实的枯萎和干缩[1]。苹果枝枯病病菌最早是1780年在美国纽约州引起病害，由于当时人们认知程度有限，误认为是雷电、烧伤、冻伤、昆虫或是人类疾病造成的病害[2]。随后，伊里诺斯大学的Thomas Burrill首先报道该病害是由一种细菌引起的[3]，1884年，通过分离与再接种试验，该推断首次得到了证明[4]，苹果枝枯病成为世界上最先发现的植物细菌病害。至本世纪初，这种病害通过世界贸易的增长而人为地传播到其他国家，并且现在已经分布于美洲、欧洲大陆、Mediterranean海岸和大洋洲的40个国家[5]。
尽管我国目前还未确定有苹果枝枯病病菌的发生，但在我国，由于果树资源丰富，苹果栽培面积居各果树之首，与世界各主产国相比，梨和苹果的栽培面积和总产均居首位，因而更加应该重视和关注这类病原菌的传播和侵入[6]。赵友福等运用地理信息系统剖析了苹果枝枯病在我国苹果和梨种植区的适生区，研究表明，国内大部分苹果及梨产区都是该病的适生区[7]。国内目前栽培的梨和苹果品种中，有许多是高度感病品种，苹果枝枯病病菌一旦传入，不但会造成极大经济危害，而且由于防治该病菌而施用农药，会给环境带来不良影响，更由于植物检疫限制，将影响果品的出口贸易，有可能影响社会的稳定性[7,8]。同时苹果枝枯病病菌危害许多蔷薇科观赏植物，受害植株枝条枯萎甚至死亡，严重影响环境美观，并且对我国的生物多样性带来影响[7]。因此苹果枝枯病的传入具备潜在的社会危害性。而风和雨对于细菌的传播是很有效的，昆虫是病原菌在花、植株和果园之间传播的主导因子，迁徙的鸟是沿海岸地区传播细菌的重要媒介[9,10]。病菌可通过气流、昆虫及迁飞鸟等快速传播，也可借带菌种子苗木、果实、被污染的包装材料等人为因素远距离传播，虽然我国目前离苹果枝枯病的发生地较远，但仍应引起高度重视，若一旦传入，在我国引起的损失将是不可估量的，特别是近几年来从疫区进口苗木的批次和数量均有上升，更应该加强国内外检疫措施，防患于未然[11]。
目前，国内对苹果枝枯病的检测鉴定还没有标准的方法，而国际上现已有多种分子生物学措施[12]，常用的检测技术有：选择性培养基分离、PCR分子检测、免疫荧光技术、DNA探针杂交方法、酶联免疫吸附分析等[13]。关于病原菌的检测，随着分子生物学技术的发展，尤其是聚合酶链式反应技术的诞生和计算机辅助分析，细菌类病原菌的检测研究也深入到了分子水平，这大大提高了细菌检测的准确性和灵敏度，而且分子生物学检测具有简单、快捷的优点[14]。本实验利用常规PCR技术，即在TaqDNA聚合酶的作用下利用苹果枝枯病菌特异性引物进行目标序列的体外扩增，其过程包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤[15]。
根据各类文献、报道等得知苹果枝枯病病原菌的危害性极大，因此实验通过植物病原细菌分离技术对苹果枝枯病组织进行病原菌的分离培养，并在分子水平检测鉴定病原菌，为后续相关研究提供分子层面的理论依据。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561586.html