我国城乡面临大面积土壤重金属污染的严重生态安全问题，尤其是镉污染因为其毒性大、性质稳定、从土壤中难以去除的特点深受人们关注。利用植物修复受镉污染的土壤，是经济有效的手段。海滨雀稗（Paspalum vaginatum）是暖季型草坪草中极具耐镉性的草种，是修复土壤重金属污染的优良材料，但其耐镉分子机制尚不清楚。有研究发现拟南芥AtABCC/AtMRP5受重金属镉胁迫上调表达，并参与重金属镉的解毒作用；本课题将克隆海滨雀稗PvABCC3基因并解析其在镉胁迫下的表达模式，通过酵母异源表达系统初步分析其耐镉功能，本研究将为海滨雀稗耐镉分子机制的研究奠定基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 植物材料 3
1.1.2 载体 3
1.1.3 试剂及试剂盒 3
1.1.4 培养基 3
1.1.5 实验仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 海滨雀稗PvABCC3基因克隆与生物信息学分析 3
1.2.2 海滨雀稗PvABCC3基因定量分析 5
1.2.3 功能分析 6
2 结果与分析 7
2.1 PvABCC3基因cDNA全长的克隆 7
2.2 PvABCC3的序列分析 9
2.3 PvABCC3蛋白跨膜结构域 10
2.4 PvABCC3基因实时荧光定量PCR 11
2.5 酵母异源耐镉表型鉴定 11
3 讨论 12
致谢： 13
参考文献： 13
海滨雀稗中个镉诱导ABCC3成员的克隆及功能鉴定
引言
我国城乡面临大面积土壤重金属污染的严重生态安全问题｡据报道,全国城市约40%的待绿化土地､乡村约有16%的土壤存在重金属超标问题，镉污染尤为严重，据报道我国受镉污染的土地面积将近200ha，是我国总耕地面积的17%左右[1]，全国大约有11个省份， *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
25个市县镉的排放量超过了标准值，如作为我国水稻大省的湖南省镉污染相当严重。与此同时，在土壤中的所有重金属元素中镉的化学性质比较稳定，很难自动降解，并且是毒性最大的元素之一，成为修复技术的难点。土壤中超标的Cd2+会迁移至植物根系表面被植物所吸收，Cd2+进入植物体内，会对植物的生长发育产生多方面不良的影响，例如Cd2+会破坏植物细胞的形态结构、破坏叶肉细胞的叶绿体结构从而影响植物的光合作用，还会抑制细胞酶的活性，影响植物体内的各种生化反应，导致植物产量和质量下降，并且由于植物是食物链底端的生产者，受镉污染的植物会被食草动物采食，经过食物链的富集作用进入人体，对人类的健康产生严重的危害。所以，土壤中镉污染的生态学修复已经刻不容缓[2]。据目前的研究进展看来，修复土壤中重金属镉方法通常有三类分别是：物理修复技术、化学修复技术、生物修复技术。通常生物修复技术又分为两类：分别是植物修复技术和微生物修复技术，植物修复技术通常是使用重金属超富集植物来吸收、富集、分解污染土壤的镉，属于原位修复方法[1]。植物修复技术主要用于矿产环境中的土壤处理,应用此技术不会给环境带来较大的压力,经济成本不高,并且有助于绿化环境[3]。植物修复首先必须找出一种对镉抗性较强或对于镉超富集的品种，并且要阐述清楚该品种耐镉的生理以及分子机制，了解植物的耐镉性及其耐镉机制有利于帮助人们发现更多镉超富集植物品种。就目前的研究进展来看，虽然人们对植物耐镉性的机理研究已经取得了重大突破，但是对于如何认为的去提高植物对镉的耐性，如何控制植物对镉的吸收量，如何利用超富集植物的耐镉基因培育出新的品种以及其耐镉基因的表达机理等问题[4]，都有待进一步解析。
海滨雀稗俗名为夏威夷草，原产于热带、亚热带的海滨地带属于禾本科雀稗属植物[5]。海滨雀稗草的叶茎色泽亮绿，茎秆分蘖的密度较高、生长速度较快且根茎健壮、并且具有很强的抵抗逆境的能力性，尤其是耐盐碱性极强，可以直接使用海水浇灌，该草还可以适应多种气候类型，沿海或者中部地区都可以广泛的种植[6]。目前，耐镉性植物的研究大多集中在早熟禾、细茎冰草、小糠草等几种冷季型牧草以及玉米、小麦、芹菜等作物蔬菜上，没有涉及暖季型草坪植物[7]。海滨雀稗作为一种优质的暖季型草坪绿化植物，不仅不会被动物采食进入食植物连，而且有研究已经表明，海滨雀稗是暖季型草坪草中耐镉性最强的草种[8]。因此选择海滨雀稗作为修复土壤中镉污染的一种材料是非常具有潜力的。
从目前的研究进展看来，土壤中的镉进入植物根部细胞的机理还未被完全阐述清楚。通常大多数学者认为，土壤中的镉进入植物根细胞主要以Cd2+或者形成镉的螯合物（Cdchelate）这两种形式来完成[9]，Cd2+或者镉的螯合物随着土壤水溶液迁移或者扩散于植物根系表面，被根细胞吸收并且先贮藏于细胞壁等质外体中[10]，然后以Cd2+或者镉的螯合物的形式通过载体蛋白的运输进入质膜，列入目前已发现的ZIP家族的转运蛋白就是一类镉的跨膜转运蛋白[9]。Cd2+或者镉的螯合物跨膜进入细胞的原生质后，植物会将大部分的Cd2+或者镉的螯合物运输到液泡中贮藏起来，植物主要是通过H+/阳离子反向运输器、P1BATP酶、ABC转运蛋白等载体蛋白将Cd2+或者镉的螯合物运输进入液泡[11]，目前已证实其中ABC转运蛋白家族的AtMRP3可将镉的螯合物转移到液泡中[12]。随着科学技术的不断进步，植物对于重金属的超富集机理的研究方向越来越多的深入到了分子水平，参与植物对于重金属的应答过程中的很多基因，并且都已经得到了克隆与功能解析，许多与植物抗逆性相关蛋白和参与信息传递的信号分子被证实参与到镉胁迫应答过程中，其中包括CAD1、GSH1、AtATM3、HMA3、HMA4、ABCC1、ABCC2[2]。这些基因都是植物在长期的进化过程为适应重金属盐胁迫所产生的，其功能是参与一系列应对重金属胁迫的生理响应，如植物细胞对重金属的螯合作用、根系富集作用、细胞壁束缚、跨膜转运以及抗氧化响应等。目前发现，ABC转运蛋白家族中的ABCC亚族都是全分子转运蛋白,且大多在N端拥有一疏水区。该亚族蛋白有重要的细胞解毒功能，可将重金属离子先与谷胱甘肽或有机酸络合，以间隔在液泡或运出细胞，因此该蛋白定位于液泡膜或细胞质膜[13]，ABCC转运蛋白对于植物将Cd2+进行解毒的机制可分为区域隔离作用、外排作用、以来线粒体的转运作用。

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