猪囊胚的差异染色方法1
生物工程的快速发展，在体胚胎的生产、和其显微操作、胚胎移植等技术都对胚胎的质量有更高的要求。在衡量胚胎的质量的指标当中，胚胎的细胞数是一个被公认为客观的评价指标，目前其在生物学，组织胚胎学等胚胎研究学科中得到较广泛的应用。动物的早期胚胎尤其是在囊胚期由内细胞团和滋养层细胞组成，这两种细胞在胚胎的发育和生长过程中起到决定性作用。实验室通过体外生产的囊胚TE细胞和ICM细胞进行不同染色，并统计各自细胞数及两者比例，可直观判断囊胚质量的优劣。近年来，此种方法已在多种动物的胚胎质量鉴定中广泛实施[2]。Handyside等[3]以根据两种细胞（TE细胞和ICM细胞）在形态结构和免疫学的差异，借助荧光染料对着两者进行染色。。Rabindranath等[4]利用钙离子作为载体已经实现对猪、牛的囊胚进行差异染色。Thouas等[5]利用Triton X-100替换了钙离子，简化了染色步骤，实现对囊胚的差异染色，降低了染色时间染色费用。李瑞岐等[6]通过对牛囊胚进行双重染色，验证了果糖对胚胎早期发育的影响。李瑞岐等[7]利用Hoechst33342/PI双染结合Triton X-100处理的方法获得了能够快速对小鼠囊胚进行双重染色，可以作为改进体外受精实验室质控的方法。芦天罡等[8]利用Hoechst33342/PI双染结合抗羊脾细胞抗血，清豚鼠补体的方法找到一种简洁有效的小鼠胚胎质量鉴别参考方法。刘帅等[9]发明了一种试剂器材简单，操作简单，计数准确，降低囊胚消耗，对猪囊胚进行简易荧光计数的方法。本实验分别通过Hoechst 33342、Hoechst 33342/PI 双染常见方法对孤雌激活后体外培养第6天得到的猪囊胚进行染色，并统计总细胞数、内细胞团细胞数，计算相关比例以评估囊胚质量。同时观察并比较这些方法在反映囊胚质量的准确性、直观性等方面的异同，从而实现更加经济、高效、简单地评价猪体外生产囊胚的质量。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物试验所用猪卵巢由本地屠宰场提供。1.1.2试剂与仪器主要仪器体视显微镜、培养箱、恒温箱、电子天平、超净工作台、融合槽、纯水机、高压灭菌锅、电子分析天平、离心机、超净工作台、水浴锅、培养皿、玻璃管、注射器（20ml，带18号针头）、移卵针等。 1.1.3主要试剂及配制BSA、FSH；LH；TCMl99粉末，谷氨酰胺；青霉素、肝素钠、链霉素、EGF、HEPES、牛血清、丙酮酸钠、无脂肪酸BSA、Hoechst33342、PI、多聚甲醛、酚红、必需氨基酸、、乳酸钙、必需氨基酸、透明质酸酶、非生物油、等。1.2试验方法1.2.1回收卵巢回收卵巢在屠宰场采集母猪的猪卵巢，一般采用的腹腔直接摘取卵巢，采集的卵巢用35生理盐水冲洗干净，保存于消毒过的保温瓶中，运回实验室放于30恒温水浴锅中备用。由于随着时间的延长，卵母细胞的成熟率会下降，因此回收卵巢时速度要快。1.2.2卵母细胞的采集从缓冲液中将卵巢取出，用滤纸吸干卵巢表面的缓冲液，之后用注射器抽取卵泡。操作时注意消毒，防止造成污染。然后将抽取的卵泡液慢慢注入15ml空离心管中，放到30℃恒温水浴锅中静置，然后取出在离心管中沉降15min左右。接着用吸管吸尽上层卵泡液，便于捡卵。捡卵时利用实体显微镜选取2层以上致密卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合物（COCs），为体外成熟做准备。1.2.3COCs的体外成熟培养（1）成熟培养盘的制备:成熟培养液有2种，1）TCM-199液+0.1%PVA+3.05mmol/L D-glucose+0.91mmol/L sodium pyruvate+75mg/Ml penicillin+50mg/mL streptomycin+0.57mmol/L cysteine+20IU/Ml PMSG+20IU/Ml Hcg+10ng/Ml EGF+10%pFF; 2)去除PMSG和HCG,其他成分同1）。每种培养液都容积为35mm培养皿中做8个成熟液的微滴，每滴体积为50uL，分2次做滴，上盖400ul的生物油，置于（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）的培养箱中平衡6-12h。（2）COCs的成熟培养:将收集的卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合物用洗卵液冲洗3遍，然后放入到成熟液中再冲洗3遍，以25-35个/滴为单位移入预先平衡的成熟培养皿中，在（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）的培养箱中培养。1.2.4脱卵丘COCs成熟培养42-44h后，移入0.1%透明质酸中作用2-3min（注意尽量不要吸到上层的油，否则吹打后会形成油层，干扰捡卵），用枪头反复轻轻吹打去掉细胞外层的颗粒细胞，然后将抽取的所有液体转到操作盘中，快速将透明质酸酶溶液中的卵母细胞转移到T2液滴中，在T2中清洗5次后放于体视显微镜下，然后选出排出第一极体的卵母细胞，放到T2液滴中待用。1.2.5卵母细胞孤雌激活（1）孤雌培养盘的制备1）制作CB盘取适量CB溶解在T11溶液中，浓度取10ug/mL. 分2次在35mm培养皿中做8个成熟培养滴，每滴50uL，上盖生物油，置于（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）的培养箱中平衡6-12h。2）制作6-D盘取6-D溶解在T11溶液中，浓度取2mmol/L. 分2次在35mm培养皿中做8个成熟培养滴，每滴50uL，上盖生物油，置于（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）培养箱中平衡6-12h。3）制作CHX盘取CHX溶解在T11溶液中，浓度取10ug/L. 分2次在35mm培养皿中做8个成熟培养滴，每滴50uL，上盖生物油，置于（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）的培养箱中平衡6-12h。4）制作T11盘分2次在35mm培养皿中做8个成熟培养滴，每滴50uL，上盖生物油，置于（100%湿度，38.5摄氏度, 5% CO2）的培养箱中平衡6-12h。（2）卵母细胞的电激活处理:操作液洗涤已经脱除卵丘细胞的成熟卵母细胞3次，用融合液润洗过融合槽，将卵母细胞在融合槽内呈一字成排列好。设定电场强度为施加126V/cm 80us 1次电脉冲（DC）进行电激活，激活完成后，静止50s。将卵母细胞取出入操作液中清洗3次。（3）卵母细胞的化学处理:将电激活处理后的卵母细胞分辨放入6-DMAP、CB及CHX盘，处理3-5h后移入PZM3中培养6天，培养条件为38.5℃，5%CO2饱和湿度。1.2.5 Hoechst 33342染色将培养6d的猪囊胚放入含4%PFA（多聚甲醛）的PBS中，放入各自的培养箱15分钟，后转入含10 μg/mL Hoechst 33342 的Hoechst染色液中染色10分钟 , 载玻片上先放少量丙三醇再将胚胎放入，用盖玻片轻轻盖住并用手指略微下压, 最后放在荧光显微镜或流式细胞仪下观察，并统计囊胚的总细胞数。1.2.6荧光Hoechst 33342 /PI双染（1）洗涤将胚胎培育6天至囊胚阶段，在室温下用PBS溶液洗涤5次。（2）通透在PBS溶液中加入0.5%Triton-100，然后将洗涤过的囊胚转移到溶液中，通透20s，然后快速将囊胚移到PBS溶液（含0.1%PVA）中再次洗涤。（3）PI/Hoechst33342染色将洗涤过的囊胚转移到PI（20ug/ml）溶液中染色50s，然后快速取出，在PBS溶液（0.1%PVA）中清洗数次。将清洗后的囊胚转移至Hoechst33342在室温下染色10分钟。（4）压片取洁净的载玻片，滴上5uL抗淬灭剂DABCO，用口吸管移入5颗左右囊胚，在液滴周围滴上少量凡士林。轻轻压上盖玻片，使凡士林充分接触载玻片，并轻微压力使囊胚得到足够的延展，切忌横向滑动载玻片。（5）拍照用荧光显微镜观察压片，使用CCD系统拍照。蓝色荧光使用UV光激发（EX 330-380，DM 400）、绿色荧光使用蓝光激发（EX 450-490，DM505）、红色荧光使用绿光激发（EX510-560,DM575）。1.2.7胚胎的质量鉴定通过显微镜下观察可以发现，染色后的胚胎囊胚中ICM细胞链接比TE细胞紧密。所以在将胚胎转移到载玻片时，应该减少液体。液体压力导致胚胎平铺在玻片上，细胞球得以分散开避免重叠,便于显微镜观察。对不同发育阶段的囊胚进行差异染色，然后统计其滋养层和内细胞团的细胞数，计算不同发育阶段囊胚的内细胞团和滋养层细胞的比例，从而鉴定胚胎质量。1.3数据处理和照片总细胞数、内细胞团细胞数以及内细胞团细胞数与总细胞数的比例使用数据统计软件SPSS进行显著性检验，采用单因素方差分析(ANOVA)Duncan’s法进行两两比较，实验所有照片由实验室照相机（Nikon 80i）拍摄。2结果与分析2.1Hoechst 33342染色结果图1 体外培养6天囊胚图2 Hoechst 33342染色（X200）实验对猪卵母细胞孤雌激活体外培养得到的第6天囊胚，从图1中选取形态清晰的囊胚进行Hoechst33342染色。在紫外光的激发下，细胞核表现为蓝色的荧光。使用倒置显微镜观察结果如图2所示。2.2荧光Hoechst 33342 /PI双染色结果图3 双染色结果（X200）图4双染色结果（X200）图5双染色结果（X200）在蓝色滤光片下观察ICM为蓝色，TE细胞为粉色。而在绿色滤光片下观察内ICM为绿色，TE细胞为红色。使用两种不同的滤光片可观察到不一样的染色效果。荧光Hoechst33342 /PI双染结果显示出滋养层为粉色，内细胞团偏绿色。在双染色过程中染色试剂的浓度与染色时间的长短极大的影响了染色的结果。图3双染结果可能是PI染色时间过长，使着色过重，视野中几乎呈现粉色，无法分清楚滋养层和内细胞团，无法计数。图4双染结果可能是试验过程中使用的作用于滋层细胞的抗体稀释度降低，个别滋养层细胞出现增大、溶解及空泡化，不能完全破坏囊胚的TE细胞，而未使囊胚的TE细胞和ICM彻底分离，TE细胞未能实现着色。因为细胞团不十分紧凑，细胞球着色不够均匀，着色后有较多的碎片。经过对试验的反复摸索得到了在荧光显微镜下清晰的分辨粉红色的TE细胞和蓝绿色ICE的染色结果（图5）。能够直观准确的对滋养层数、内细胞团数等进行计数，从而反映囊胚的质量。表1 猪体外囊胚细胞计数结果项目总细胞数（个）Total cell number内细胞团数（个）ICM cell number滋养层细胞数（个）TE cell numberICM/Total双染色30±1.19±1.021±1.20.30在囊胚的染色过程中也需要注意到，单一的依靠外形观察室不能准确的评价囊胚的质量好坏。外观看起来好的囊胚双染后结果不同。原因可能是内细胞团和滋养层细胞数不同，细胞的清晰度也不同，对染色染料的吸收程度也不同。虽然经过体外培养而成的囊胚ICM和TE细胞数都明显少于体内发育的囊胚，但其比例却保持相对一致。而Willadsen等[16]研究发现，ICM细胞所占比例的降低则会引起发育能力下降。所以，从内细胞团所占的比例的大小，即可判断囊胚质量的好坏。试验对总细胞数、内细胞团细胞数以及内细胞团细胞数与总细胞数的比例统计，可知双染色的内细胞团及内细胞团所占的比例适合，结果表明双染能够更加直观、准确的反映囊胚的质量，故荧光Hoechst33342 /PI双染这种方法较好。3.讨论Hoechst 33342是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在激发光照射下发出蓝色荧光。通常情况下，Hoechst33342这种荧光染料只有部分能穿过细胞膜进入细胞，让细胞染上淡蓝色。但是如果细胞凋亡，其膜的通透性增强，因此进到已经凋亡细胞中的该染料比正常细胞多，导致荧光反射的强度变强。同时，已经凋亡细胞的染色体空间构象发生变化，导致Hoechst33342与NDA结合概率增加。其膜上的p-糖蛋白功能丧失导致Hoechst33342在细胞内累积从而导致荧光反应加强。在使用紫外光激发时会细胞会出现蓝紫色荧光。试验中使用Hoechst 33342染色作为对照组，从而得出卵母细胞的总数。碘化丙啶它不能穿过完整的细胞膜，但PI能穿过凋亡后期细胞和死细胞，从而进入细胞核，使其染红。但是染色时间过长会造成着色过重，无法分辨滋养层与内细胞团。所以在试验中要控制好染色的时间，避免出现图3的情况。有研究表明体内囊胚的TC细胞随胚胎发育明显增多，而ICM细胞的发育并无明显增多[1]。ICM/TC的比值呈明显降低，结果说明在这一时期TC细胞增殖比ICM细胞速度快。Willadsen等[16]研究认为，ICM细胞所占比例的降低会引起胚胎发育能力的降低。所以，从内细胞团数及其所占比例均可以反映出囊胚质量的优劣。从试验结果可以看出双染中PI染色能够使滋养层细胞染红，利于滋养层细胞的计数。但是要特别注意染色试剂的浓度。随着抗血清稀释度降低，囊胚腔缩小，个别滋养层细胞增大、溶解，出现空泡化，表明抗血清有效作用于滋层细胞。如果稀释度太低则只能破坏一部分囊胚的滋养层，合理稀释度的血清抗原能够破坏囊胚细胞的滋养层，从而使囊胚的TC和ICM完全分离，达到两种细胞分别染色的目的。图4的染色结果属于这种情况。实验表明使用PI/ Hoechst33342双重染色方法，用PI染料染色TC细胞，用Hoechst33342染细胞核，再统计总细胞数和ICM细胞数，然后计算两者比例。可知双染色的内细胞团及内细胞团所占的比例大小，通过比较内细胞团及内细胞团所占的比例的大小，便能够更加直观，准确的反映囊胚的质量，为猪囊胚质量的鉴别提供参考。 致谢参考文献孟令君,高建明,刘云海,等.双重荧光染色法评定小鼠体内外囊胚质量的研究[J].动物生产,2008,44(3):49-51.万鹏程,石文艳,刘守仁,等.绵羊体外受精胚胎培养系统优化与囊胚差异染色[J].新疆农业科学,2010,47(12):2469-2476.Handyside A H, Hunter S. 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Zygote, 1997, 5: 309.
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 试验动物 2
1.1.2试剂与仪器 2
1.1.3主要试剂及配制 2
1.2试验方法 2
1.2.1回收卵巢 2
1.2.2卵母细胞的采集 3
1.2.3COCs的体外成熟培养 3
1.2.4脱卵丘 3
1.2.5卵母细胞孤雌激活 3
1.2.5 Hoechst 33342染色 4
1.2.6荧光Hoechst 33342 /PI双染 4
1.2.7胚胎的质量鉴定 5
1.3数据处理和照片 5
2结果与分析 5
3 讨论 8
参考文献 9
猪囊胚的差异染色方法
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/52733.html
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