本研究旨在利用大肠杆菌原核表达猪链球菌2型类溶血素蛋白，并制备相应的多克隆抗体。采用PCR 法从猪链球菌2 型强毒株SS2-1基因组扩增目的基因HlyC，即类溶血素基因，构建重组表达载体并进行HindIII/SalⅠ双酶切鉴定，鉴定阳性者用IPTG诱导重组蛋白表达，其产物采用SDS-PAGE电泳法进行鉴定，鉴定阳性者采用His 亲和层析柱进行纯化，制备兔抗重组蛋白血清。通过溶血活性试验和血平板溶血活性检测评定类溶血素蛋白功能。 结果显示成功将目的基因插入到表达质粒中，并获得纯度较高的重组蛋白，利用重组蛋白作为抗原所制备的重组蛋白兔多抗血清抗体效价为1 12400 以上，重组蛋白rHlyC无裂解兔红细胞的能力。本研究中成功利用大肠杆菌对HlyC进行了原核表达、纯化及溶血活性的测定，以期为进一步研究HlyC基因的确切功能提供借鉴。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 菌株和质粒2
1.1.2 试剂2
1.1.3 仪器3
1.1.4 动物3
1.2 试验方法 3
1.2.1 目的基因的PCR扩增及克隆3
1.2.2 测序质粒的构建3
1.2.3 重组表达载体的构建和鉴定4
1.2.4 HlyC同源序列比对分析4
1.2.5 重组蛋白的表达及其产物的纯化4
1.2.6 兔抗重组蛋白血清的制备4
1.2.7 溶血活性测定4
2 结果与分析5
2.1 HlyC基因生物信息学分析5
2.2 目的基因的扩增5
2.3 重组表达载体的鉴定6
2.4 重组蛋白的表达及纯化6
2.5 重组蛋白兔多抗血清制备及抗体效价检测7
2.6 溶血活性检测7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
猪链球菌2型类溶血素蛋白的原核表达及其抗血清制备
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 

引言
猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是一种极其重要的人兽共患病原菌，早在1987 年，由KilpperBalz 首次发现[]。由于荚膜多糖的抗原性存在差异，据此进行分类，统共存在33个血清型，其中2 型 ( Streptococcus suis type 2 , SS2) 最为普遍、感染范围最广、毒力强劲、危害最为严重[]。不仅可以引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎以及急性死亡，也可感染生猪从业相关人员，严重者甚至致其死亡。1998年江苏境内与2005年四川境内大规模地暴发了由SS2引致的人及猪的链球菌病，引起了世界范围内的广泛关注。近年来，越南、泰国和印度尼西亚等东亚国家也陆陆续续报道了多起人感染SS2并死亡的病例。
目前发现的猪链球菌的毒力因子多达数十种，包括荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)[]、溶菌酶释放蛋白( Muramidasereleased protein，MRP)[]、胞外蛋白因子(Extracellular protein factor, EF)[]、纤连蛋白结合蛋白、溶血素( Suilysin，SLY)[]、血清浑浊因子、谷氨酸脱氧酵(Glutamate dehydrogenase,GDH)[]、双肽肽酶IV（Dipeptidylpeptidase IV ，DPP IV）、转肽酶A （SrtA）[]和次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）等。此外，信号传导系统与细菌毒力密切相关，如双组份调控系统如SalK/R、CiaR/H、VirR/S、Ihk/Irr 和NisKNisR[]等，以及“孤儿”应答调控因子RevS[]、 CovR[]和独立的转录调节因子(Standalone Regualtor) Rgg、CcpA）[]等，直接或间接参与细菌黏附宿主细胞、体内存活情况、免疫逃逸等[]。
溶血素，作为猪链球菌的重要的毒力相关因子，对不一样的宿主细胞，如脑微血管内皮细胞，上皮细胞系和巨噬细胞等均具有不同程度的细胞毒性。然而，溶血素在亚裂解浓度也能诱发其他细胞反应[] 。在猪链球菌2 型菌株侵入和溶解细胞的过程中以及其导致脑膜炎的形成的过程中发挥举足轻重的作用[][] 。同时，溶血素为阳性的菌株在通常情况下更倾向于诱发系统性的感染[][]。
猪链球菌中存在一个与多种链 球菌的溶血素具有较高的同源性的蛋白HlyC（hemolysins and related proteins containing CBS domains，HlyC），目前其确切功能尚无一定论。本研究克隆出猪链球菌2型类溶血素蛋白编码基因并进行原核表达, 纯化重组蛋白，制备其相应的多克隆抗体，为深入研究该基因的明确功能夯实基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株和质粒 猪链球菌2型强毒株SS21，1998年分离自江苏南通病死猪，江苏省农科院兽医所人兽共患病研究室保存。表达质粒pET28 a 及其宿主菌大肠杆菌Trans5α和BL21(DE3)，人兽共患病研究室保存；连接通用载体pMD18T vector 为TaKaRa 公司产品。
1．1．2 试剂 PCR扩增试剂盒，T4 DNA 连接酶及其Buffer，限制性内切酶HindIII和SalⅠ均购自大连TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自 Axygen 公司；DNA marker 、protein marker 购自Fermentas 公司；氨苄青霉素(Ampcillin)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma 公司；GE Healthcare公司的HisTrap Purification Kit；HisTag 单克隆抗体购自北京天根生物技术公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG 和抗小鼠IgG 购自南京诺唯赞生物技术有限公司；DAB 显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。
1．1．3 仪器 离心机（Eppendorf 5804R，Germany）购自德国艾本德中国有限公司；德国Biometra Easycycler PCR仪；全自动凝胶成像分析仪（JS780）购自上海培清科技有限公司；Biorad蛋白电泳仪/伯乐小型垂直电泳槽（MiniPROTEAN Tetra）购自北京赛百奥科技有限公司；DYCP31DN多用途水平电泳仪（槽）购自 北京六一仪器厂；美国Qsonica 超声波细胞破碎仪购自上海芝高生物科技有限公司。
1．1．4 试验动物 新西兰白兔，1.52.0kg，购自青龙山动物繁殖场。
1．2 试验方法
1．2．1 目的基因的PCR扩增及克隆 根据目的基因序列设计并合成引物, 进行PCR 扩增。上游引物为5cgc ggatcc ATCAGCCGTATTACTCCTATG；划线部分为HindIII酶切位点;下游引物为5ccg ctcgag tta ATCGGTTTCTTCTTTCTCC, 划线部分为SalⅠ酶切位点。引物由上海英骏生物技术公司合成。PCR反应体系：5×PrimeSTAR buffer （Mg2+ plus）10μL , 2 .5mmol/ L dNTP Mixture 4μL , 模板DNA 2μL , 10nmol/μL 的上游, 下游引物各1μL , DNA聚合 酶0 .5μL , ddH2 O 31.5μL 。PCR程序：94℃ 2min ,98℃ 10s , 55℃ 15s , 72℃ 1min , 共30个循环, 最后72℃延伸5min 。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

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