：鸽疱疹病毒感染是由鸽疱疹病毒I型（Pigeon herpesvirus type I, PiHV-1）引起的一种病毒性传染病。2015年9月，江苏某赛鸽场发生部分赛鸽病死，为了查明该场是否有鸽疱疹病毒感染，并为建立该赛鸽场的发病库提供数据，从而提出相应的防控措施。本文应用PCR 方法对采集的病料进行鸽疱疹病毒的检测，并通过扩增、纯化回收、与PMD18-T载体连接转化、测序结果与已知的序列比对、同时进行进化树分析。结果显示：16例病死赛鸽中有4例为PiHV阳性，推断该赛鸽场具有鸽疱疹病毒感染；测序获得3组序列结果，比对显示3组序列属于同一毒株，且与泰国曼谷分离株，及中国鸽疱疹病毒I型BJ株、HLJ株的DNA聚合酶基因碱基覆盖度均达到100 %，基因序列的同源性达到99 %；DNA聚合酶基因进化树分析表明，分离到的NJ201549.9株与泰国曼谷株KM010015.1 的同源性最高，其次是中国北京株KJ995972.1及中国黑龙江株KM280875.1。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论） 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1病料 2
1.1.2主要试剂 2
1.1.3主要仪器 2
1.2方法 2
1.2.1组织DNA提取 3
1.2.2 引物的设计与合成 3
1.2.3鸽疱疹病毒PCR检测 3
1.2.4琼脂糖凝胶/PCR产物纯化 3
1.2.5 PMD18T Vector 连接转化 3
1.2.6质粒提取（PD1211）4
1.2.7 DNA测序 4
2结果与分析 4
2.1临床症状与病理变化 4
2.2 样品中鸽疱疹病毒的PCR检测 5
2.3 DNA序列分析 5
2.4系统进化分析 6
3讨论 6
致谢　8
参考文献8鸽疱疹病毒感染的PCR检测与序列分析
引言
在世界上，大约有一千多种
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
鸽子的品种。鸽子不仅具有通信、竞翔、观赏和食用的价值，而且还具有军事、医学、科研等方面的重要价值。通常人们可以根据鸽子不同的实用价值，将其分为三类：观赏鸽、通信鸽和肉用鸽。在过去的十几年里，人们逐渐地认识到鸽子广泛的实用价值，也正因如此，使得我国养鸽产业呈现快速的发展趋势，同时也获得了良好的经济效益。然而，随着国家市场经济的不断发展，许多养鸽场，养殖户一味地为了追求经济收益，盲目地扩大养鸽生产，反而忽视了鸽子养殖过程中疾病的防控与治疗工作，从而导致鸽子的疫病不断发生，同时也造成了一定的经济损失。
在我国，据不完全统计，鸽子的疾病已多达 6070种[1]，而且不断地有新的鸽子疾病出现。在各类鸽子的疾病中，报道最多的是病毒性传染病，其对鸽子的危害性也是最大的。近几年，赛鸽业逐渐的发展起来，而在赛鸽养殖过程中，赛鸽的呼吸系统的疾病发生逐渐增多，其中以鸽疱疹病毒感染对赛鸽的影响较大，不仅能引起赛鸽的体能下降甚至死亡，而且还能造成重大的经济损失。
鸽疱疹病毒病是由鸽疱疹病毒I型（Pigeon herpesvirus typeⅠ，PiHV1）感染引起的一种病毒性传染病。鸽疱疹病毒I型归属于疱疹病毒科，是 β疱疹病毒亚科的一个成员，其与分离自猫头鹰科和隼科的疱疹病毒同属于一个血清群[2]。鸽疱疹病毒不仅具有典型的疱疹病毒的形态学特征，而且其主要的理化性质与其它疱疹病毒具有相似性。PiHV1 在世界上具有较为广泛的分布范围，且早在 1945 年就有对其的相关报道，并先后在英国、前捷克斯洛伐克、澳大利亚、比利时、匈牙利、德国、法国和意大利被发现和分离[3]，而且所有分析过的 PiHV1 毒株似乎均属于同一血清型[4]。各年龄段的鸽子均可以感染PiHV1，但主要感染幼龄阶段的鸽子，感染后的鸽子临床上多以鼻炎、结膜炎特征为主，有时也会出现食欲减退、腹泻、呕吐、精神萎靡、神经等症状。但由于本病的临床诊断过程时间较短，仅有几个小时，所以经常没有明显临床症状而仅发现病死的鸽子。
本文根据已经在GenBank 上发表的鸽疱疹病毒DNA聚合酶基因序列，针对其保守序列设计了一对引物，并对采集来自江苏省南京市浦口某赛鸽场16份病死赛鸽肝脏组织样品进行了检测，继而对检测中呈现阳性结果的样品扩增，克隆，测定基因序列，并进行分析与比较，现将结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 从江苏省南京市浦口某赛鸽场采集病死赛鸽的肝脏组织16份并迅速冷冻备用
1.1.2 主要试剂 Tris平衡酚，购自北京索莱宝科技有限公司；10 mol/L醋酸铵；苯酚；无水乙醇；超纯水；10 mmol/L TrisHCL pH值 8.0；100 mmol/L Na2EDTA pH值 8.0；5 g/L SDS（十二烷基硫酸钠），购自Sigma公司；Goldview 核酸染料，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；琼脂糖、Marker 2000、蛋白酶K、PMD18T Vector、2x Taq Master PCR Mix，均购自大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞自制；1x TAE自制；琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒、质粒提取（PD1211）试剂盒，购自南京天为生物科技有限公司
1.1.3 主要仪器 PCR仪，购自德国耶拿分析仪器股份有限公司；电泳槽，购自上海珂淮仪器有限公司；凝胶成像系统，购自上海培清科技有限公司；THZC台式恒温振荡器，购自太仓市华美生化仪器厂；CT14RD离心机，购自上海天美生化仪器设备工程有限公司；DK8D型电热恒温水槽、隔水式恒温培养箱，购自上海森信实验仪器有限公司
1.2 方法
1.2.1 组织DNA提取 ①将采集的肝脏组织于20 ℃反复冻融3次，取冻融后组织块0.51.0 cm3置于匀浆器中，加入10 倍体积的裂解液进行研磨匀浆，并将匀浆液收集至无菌试管中，置于37 ℃恒温水槽水浴 1 h；②取2.0 mL无菌离心管，向其中加入800.0 μL 组织匀浆液（组织匀浆液不能超过离心管的1/2体积），并取8.0 μL 蛋白酶K加入，在50 ℃恒温水槽水浴3 h，冷却至室温；③再向其加入800.0 μL Tris平衡酚溶液，颠倒混匀至呈现乳浊液，混匀后，置于4 ℃离心机，10000 rpm/min，离心15 min，吸取上层溶液，并用一定量苯酚溶液连续两次抽提；④吸取上层溶液并将其加入新的1.5 mL无菌离心管中，加入0.2倍体积的 10 mol/L 醋酸铵及2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，置于4 ℃离心机，10000 rpm/min，离心15 min，取出弃去上层清液；⑤加入70 % 乙醇溶液轻轻吹打DNA 沉淀2次，混匀，置于4 ℃离心机，10000 rpm/min，离心15 min，弃去上层溶液，收集下层DNA。并用吸水纸吸去沉淀表面乙醇溶液，注意不能触碰沉淀，在室温下置于通风口处吹干；⑥加入 40.0 μL 的TE 溶解液或超纯水溶解重悬，置于 20 ℃保存备用。

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