：本课题前期已完成idgs-Sfp报告系统的构建；根据Sfp结构预测其可能的切割位点；并已筛选出Sfp的三个潜在氨基酸切割位点：1，2，3。通过在三个位点构建分别融合表达NZ和CZ两个互作小肽的载体，转化idgs组成型表达菌株感受态后观察大肠杆菌的表型即可判断Sfp是否能重建功能，并且通过与野生Sfp及对照组对比评价各个切割位点作为片段化互补分析技术的可行性。结果表明：融合了互作蛋白的三个位点的构建均可使大肠杆菌颜色变蓝，与野生Sfp一致，转化背景干净。1,3号位点的对照组构建大肠杆菌不同程度变蓝，但2位点对照组构建未变蓝，由此推测出Sfp的2号切割位点最适用于构建分裂蛋白重组装系统研究蛋白相互作用。
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 1
1 材料与方法 2
1.1菌株及质粒 2
1.2试剂与仪器 2
1.3 设计原理 4
1.4 Goden Gate Cloning 4
1.5 SS.idgsm大肠感受态的制备 5
1.6 质粒的转化 6
1.7 相关质粒的构建 6
1.8 质粒的鉴定 6
1.9 质粒的表型观察 6
2 结果 7
2.1三个切割位点构建的质粒的结果 7
2.2三个位点构建质粒37℃ 过夜，室温2h培养表型结果 8
2.3 三个位点构建质粒28℃，24h培养表型结果 9
2.4 三个位点构建质粒液体LB 28℃过夜培养结果 10
4 讨论 11
参考文献 12
致谢 14
英文缩写词表
英文缩写
英文全称
中文全称
idgs
Indigoidine encoding gene
蓝靛素编码基因
Amp
Ampicillin
氨苄西林
Chl
Chloromy
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
cetin
chloromycetin
chloromycetin
氯霉素
Kana
Kanamycin
卡那霉素
PCA
Protein fragment Complementation Assay
蛋白片段化互补分析
SS.idgsm

idgs组成型表达菌株（大肠杆菌）
PPI
Protein Protein Interaction
蛋白互作
GGC
Golden Gate Cloning

Sfp蛋白分裂重组装系统的构建
引言
在一切生命体中，生物大分子的相互作用，特别是蛋白蛋白相互作用主导着生命活动。蛋白质之间的相互作用即通过与其配体结合或作为一个大的生物复合体中的一部分是蛋白质发挥作用的主要形式，生物体各类疾病的产生都直接或间接的与蛋白之间的相互作用有关，一个简单易用、灵敏度高的研究蛋白互作的工具在研究在兽医基础研究领域必定具有广泛的应用范围和巨大的应用价值，例如G蛋白偶联途径中信号转导蛋白质的互作研究。已成熟应用的生物技术有免疫共沉淀[1] 、酵母双杂交( Y2H)[2] 、亲和层析质谱( APMS)[3] 和荧光共振能量转移( FRET) 技术[4] 等。但它们都具有一定的局限性，如特异性差，假阳性率高等，不能检测细胞内发生的蛋白质复合体组装、定位、迁移、降解等动态过程。1958年Richards FM等在核糖核酸酶中发现蛋白片段可重组装成为功能性的复合物[5]，随后在β半乳糖苷酶中也得以验证[6]。分裂蛋白重组装系统在技术上的飞跃来是在Johnsson 与Varshavsky对泛素蛋白恰当的互补片段分析，这种方法消除了对互作蛋白核定位的要求以及酵母双杂交中的主体翻译机制[7]。长期研究生物大分子互作过程中，分裂蛋白重组装系统技术应运而生，并广泛应用于抗体筛选。蛋白片段化互补分析（Protein fragment Complementation Assay，PCA）是近年发展起来研究蛋白与蛋白相互作用的一门新技术，典型的PCA技术已成功地利用荧光蛋白(FP)[8]，β 内酰胺酶[9]及荧光素酶[10]等报告蛋白的片段互补进行胞内蛋白分子相互作用研究，具有高敏感度、可逆性、高通量化、适用范围广等特点。可用于动态定位分析细胞内蛋白质分子相互作用，也可应用到蛋白质文库、cDNA文库互作配体筛选和高通量药物筛选等。本研究将在idgsSfp报告基因系统基础之上，构建一个全新的分裂蛋白重组装系统。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
SS.idgsm（idgs组成型表达菌株）菌株由本实验室保存。大肠杆菌用 LB固体及液体培养，培养基中添加一定浓度的抗生素。大肠杆菌：氨苄青霉素（Ampcillin, Amp）100 (g/mL。大肠杆菌JM109、BL21感受态细胞由本实验室保存的菌株进行制备。克隆载体质粒pUC19质粒由本实验保存。本实验所用的菌株、质粒见表11，引物见表12。
1.2 试剂与仪器
氨苄青霉素（Ampcillin）为 sigma公司产品。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶为Takara公司产品，DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒等为天根公司产品。其余试剂为进口或国产分析纯。引物由英俊公司合成。PCR仪为Applied biosysterms公司产品；凝胶成像系统为BioRad公司产品。恒温摇床为海门其林贝尔公司产品。恒温培养箱为上海BOXUN产品。
表11菌株及质粒
TABLE 11 Bacterial strains and plasmids used in this study
Bacterial strains and plasmids
Description
Source or reference
Bacterial strains
E.coli JM109
Cloning host for the recombinant plasmids
Our laboratory
E.coli BL21
Host for expressing the recombinant plasmids

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/51078.html