：随着大环内酯类抗生素在临床中的大量使用，猪链球菌对其耐药性日益增强，且多重耐药菌株的分离率也不断上升，猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性水平传播机制仍不明了。本试验初步探讨细菌整合性和结合性元件（ICE）介导红霉素基因ermB在猪链球菌HB1011和BA853间水平传播的机制。本实验首先采用PCR和RT-PCR方法检测了细菌不同生长期及不同药物丝裂霉素、红霉素和环丙沙星对ICE环化率的影响，然后采用滤膜接合实验研究了ICE元件在猪链球菌不同菌株之间的水平传播情况。结果显示：处于对数期的HB1011菌株ICE的环化率受药物影响较大，且与处理时间呈正相关性，单稳定期细菌环化率与时间无相关性。菌株HB1011的ICE可通过接合进入受体菌BA853菌株内，PCR检测结果显示抗性平板中筛选到的结合子含有供体菌ICE的特异性基因片段，且结合子中可以检测到ermB基因并且对红霉素耐药性增强。结果提示猪链球菌的ICE可携带红霉素耐药基因ermB并在不同菌株之间进行水平传播。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌株2
1.1.2 培养基、药物2
1.1.3 仪器2
1.2最小抑菌浓度的测定2
1.2.1 细菌悬浊液的制备2
1.2.2 采用微量稀释法进行MIC的测定2
1.3 HB1011和BA853的ICE环状形式的测定3
1.3.1 设计引物3
1.3.2 PCR扩增目的片段3
1.4 HB1011菌株ICE环化率的测定3
1.4.1 设计引物3
1.4.2 PCR反应体系4
1.4.3 PCR产物纯化回收4
1.4.3目的基因片段与T载体连接5
1.4.3重组质粒的转化5
1.4.5阳性克隆的筛选5
1.4.6 质粒DNA的提取5
1.4.8 环化率的计算6
1.5滤膜接合实验6
1.6 接合子的验证6
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

1.7 接合子药敏试验6
2 结果与分析6
2.1 HB1011和BA853的MIC测定结果6
2.2 HB1011和BA853的ICE环状形式的验证7
2.3 ICEHB1011环化率的测定7
2.4 接合实验及接合子的验证、8
2.5 接合子药敏试验9
3 讨论9
致谢11
参考文献12
ICEHB1011介导ermB在猪链球菌间水平传播的机制
动物医学院学生 郑阳
引言
猪链球菌(Streptococcus suis)是重要的人畜共患病传染源，该菌已给养猪业造成了巨大的损失，随着大环内酯类药物在养猪业的广泛应用，猪链球菌对大环内酯类药物的耐药性菌株也迅速增加[1]。
ICE (Integrative and conjugative element)是位于细菌染色体上的一种可移动的基因元件，可携带部分耐药基因。它与接合性质粒相似，可以通过接合的方式进行转移，部分耐药基因则借由ICE元件在同种甚至不同种的菌株间水平转移，使得细菌耐药的散播更快速和广泛，加速了临床耐药的产生[2]。细菌可移动遗传元件还包括质粒、转座子、噬菌体、基因组岛等，ICE因其在细菌耐药基因水平转移中的重要作用而越来越受到人们的关注。ermB基因的克隆和水平传播导致了一些国家的耐红霉素肺炎链球菌株的高度流行[3],国内临床分离的猪链球菌对大环内醋类抗生素的耐药主要由ermB介导，呈红霉素高度耐药[37]。
细菌间的水平传播机制通过三个方面：转化、噬菌体介导转导和接合。本次试验以链球菌HB1011和BA853为研究对象，通过对HB1011的ICE环化率测定，探索丝裂霉素和环丙沙星药物对ICE环化率的影响，最后通过滤膜结合实验初步探讨了猪链球菌中携带ermB耐药基因的ICE在不同菌株之间的水平转移情况。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株
猪链球菌株HB1011分离自河北猪场病猪，经测序鉴定其含有携带ermBtetO的ICE元件。BA853菌株为ATCC收藏菌株，大学动物医学院微生物教研组保存。所有菌株经过含5 %犊牛血清的TSB液体培养基和含1.5 %琼脂TSB平板传代培养鉴定后备用。
1.1.2 培养基、药物
TSB液体培养基：每250 g培养基含有酪蛋白胨17g、大豆木瓜蛋白酶消化物3 g、葡萄糖2.5 g、氯化钠5 g、磷酸二氢钾2.5 g；TSA平板：1.2%琼脂TSB平板。
红霉素、夫西地酸、四环素和利福平均购于biosharp生物科技公司。
1.1.3 仪器
96孔聚苯乙烯板、37℃培养箱、超低温冰箱、移液器、SX700高压蒸汽灭菌锅（日本TOMY公司）、双层恒温空气摇床、普通PCR仪，凝胶成像系统；高速冷冻离心机：Sigma Microfuge 22R Centrifuge；台式超净工作台（苏净集团苏州安泰科技技术有限公司）、WH3型微型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）、水平电泳槽（北京六一仪器厂）、Realtime PCR仪（美国Applied Biosysterms）。
1.2 最小抑菌浓度（MIC）测定
根据CLSI即美国临床检验标准委员会推荐的微量稀释试验方法[8]测定红霉素、四环素、利福平和夫西地酸对HB1011和BA853的最小抑菌浓度（MIC）。
1.2.1 细菌悬液的制备
取上述HB1011和BA853两株猪链球菌冻存液，划线接种于TSA平板，37℃过夜培养，分别用接种环挑取单个菌落至已加入血清的TSB培养基中，37℃振荡培养至对数生长后期，将菌液用TSB培养基调至0.5个麦氏浊度单位后备用。
1.2.2 采用微量稀释法进行MIC的测定
将制备好的菌液加入96孔细胞培养板中（第一列加180μL，最后一列加入空白培养基作为对照，其余每孔加100μL），然后取20μL配置好的一定浓度的药物加入第一列培养孔中，并倍比稀释至10孔，11孔作为空白组细菌生长对照；最后将处理好的96孔细胞培养板置于37℃恒温培养箱培养过夜，次日观察并记录结果。
1.3 HB1011和BA853的ICE环状形式检测
1.3.1 设计引物
根据参考文献[8]设计用于检测ICE环化形式的引物。引物序列、引物组合及扩增片段大小见表1。
表1 ICEHB1011环状形式检测所用引物及引物组合
Table 1 Primers used in detection of circular form

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