：禽流感病毒（AIV）是导致养禽业经济损失的一个重要原因，为建立一个TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，针对H9亚型AIV的HA基因保守序列设计了一对特异性荧光定量反转录引物和一条探针，该试验与其他禽类病毒不出现交叉反应，对AIV最低检测限度为100拷贝，敏感性是传统RT-PCR检测方法的100倍，统计分析表明有良好的重复性。本法具有快速、特异性高、敏感性高的特点，可应用于AIV的兽医实验室诊断以及制药企业疫苗病毒的定量检测。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 引物和探针设计2
1.2 病毒的扩增与准备 2
1.3 病毒RNA提取与反转录 2
1.4 构建标准质粒模板 2
1.5 荧光定量PCR的优化2
1.6 荧光定量PCR方法的敏感性试验3
1.7 荧光定量PCR方法的特异性试验 3
1.8 荧光定量PCR方法的重复性试验3
2 结果与分析3
2.1 荧光定量PCR标准曲线3
2.2 荧光定量PCR方法的敏感性3
2.3 荧光定量PCR方法的特异性 4
2.4 荧光定量PCR方法的重复性5
3 讨论5
致谢6
参考文献6
H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立
引言
1 材料与方法
1．1 引物和探针设计
HA基因序列来源于Genbank核酸数据库：使用DNAman软件比对这些基因片段，寻找出相对保守序列，用Primer Primier5.0根据保守序列设计出一对荧光定量PCR引物和一条探针。引物和探针均由上海生工合成。
表1 引物和探针序列
引物和探针
序列
长度
位置
RHAF
CAGAAGAAGAAGGCAGCAA
20
16411660
HAP<
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
br /> FAMCAAGAGATGAGCCGACAGTGGAABHQ1
23
16061622
RHAR
AATGTGATGAGCARTCCATGG
21
144214625
1．2 病毒的扩增和准备
H5N1、H7N9、H9N2、IBV、NDV活毒株，由实验室保存。毒株经过SPF鸡胚扩增培养，研磨鸡胚尿囊液培养物后转移至离心管，10000×g 4℃离心10min，取上清保存在80℃备用。
1．3 病毒RNA提取与反转录
吸取500μl上清液，加700μl TRIzol快速提取总RNA，剧烈震荡，静置515min，充分反应，期间震荡摇匀，加氯仿200μl，剧烈震荡，静置5min，12000r/min,4℃离心15min，吸取600μl上清液，加等体积异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀，20℃静置30min，12000r/min，4℃离心15min，弃上清，加1mlDEPC水配置的75%酒精，颠倒混匀，12000r/min，4℃离心5min，弃上清，吸干酒精，加11μl无RNA酶水溶解RNA。
反转录过程：Random hexamers 1μl，RNA 3μl，DEPC水4μL，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却，并在冰上放置2min；再取上述反应液8μL，2×RT mix 10μL，HiScript II Enzyme mix 2μL，混匀，25℃ 5min，50℃ 45min，85℃ 5min，得到cDNA.
1．4 构建标准质粒模板
HA基因全长序列插入载体。采用Mastercycler pro PCR仪（eppendorf公司），阳性质粒为模板扩增出HA 基因片段全长，总反应体系为50 μl：包括25 μl 2×phanta max buffer,1 μl dNTP mix,0.5 μl phanta max superfidelity,0.5 μl Takara Taq，1 μl cDNA,1 μl上游引物,1 μl 下游引物,ddH2O补足50 μl。反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸2min；30个循环，72℃10 min完成最后延伸，并使单链产物退火成双链。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用OMEGA胶回收试剂盒纯化。
全长HA基因的DNA 5 μl，0.5 μl pMD18 T载体，4.5 μl solution I，16 min连接30 min，连接产物导入感受态细胞内扩增，涂氨苄抗性平板后挑取单克隆在含1%氨苄的LB液体培养基内，37℃摇菌过夜，菌液PCR鉴定连接产物。
阳性菌液用天根生化科技质粒提取试剂盒提质粒，NanoDrop2000系统（Thermo公司）测浓度。另取800 μl菌液加甘油保种，80℃保存。
质粒拷贝数采用以下公式计算，连接产物稀释成1×1010拷贝/μl 作为标准质粒，20℃保存备用。
HA DNA (拷贝数/μl)=6.022×1023 (分子数/mol)×浓度 (g/μl)/（DNA长度×660）
1．5 荧光定量PCR的优化
取标准质粒做1×107拷贝/μl1×101拷贝/μl梯度倍比稀释做荧光定量PCR，设置阴性对照，每个样本至少重复3次。改变荧光定量PCR的引物及探针用量以及退火温度，得到最终优化的荧光定量PCR体系和反应程序。总体系20 μl：10 μl Premix Ex TaqTM,0.4 μl RHAF(10 μM),0.4 μl RHAR(10 μM),0.2 μl HAP,模板1 μl，剩余用水补齐至20 μl。反应程序为：95℃60s；95℃10s，54℃20s，40个循环。用Light Cycler® 96（Roche公司）荧光定量PCR仪扩增。
用优化过的荧光定量PCR方法，以1×107拷贝/μl1×101拷贝/μl梯度稀释的质粒为样本来绘制Ct值拷贝数标准曲线。
1．6 荧光定量PCR方法的敏感性试验
取标准质粒10倍倍比稀释，每个梯度质粒依次为1×107拷贝/μl，1×106拷贝/μl，1×105拷贝/μl，1×104拷贝/μl，1×103拷贝/μl，1×102拷贝/μl，1×101拷贝/μl，并设置阴性对照，每个样本至少重复3次，分别用荧光定量PCR方法和普通PCR方法检测。测定荧光定量PCR方法最低检测限度。
1．7 荧光定量PCR方法的特异性试验
用H9N2,H5N1,H7N9, IBV, NDV 5种活病毒株，并设置一个没有模板的阴性对照，检测该荧光定量PCR方法的特异性。

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