5羟色胺对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂 2
1.1.2仪器 3
1.2方法 3
1.2.1细胞培养与处理 3
1.2.2 ELISA检测猪乳腺上皮细胞中FAS、LS、βCasein含量 3
1.2.3 Realtime PCR检测EpH4Ev细胞FAS基因表达的变化 3
1.2.3.1细胞总RNA的提取 3
1.2.3.2反转录 4
1.2.3.3引物设计与合成 4
1.2.3.4 Realtime PCR 4
1.2.4 Western blot检测EpH4Ev细胞βCasein含量的变化 4
1.2.4.1蛋白浓度的测定 4
1.2.4.2 Western blot 4
2 结果与分析 5
*景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072#
2.1 5HT对乳腺上皮细胞中FAS含量的影响 5
2.2 5HT对猪乳腺上皮细胞中LS含量的影响 5
2.3 5HT对乳腺上皮细胞中βCasein表达的影响 6
3讨论 6
3.1 5HT对乳腺上皮细胞FAS及FASN表达的影响 6
3.2 5HT对乳腺上皮细胞LS表达的影响 7
3.3 5HT对乳腺上皮细胞βCasein表达的影响 7
致谢 8
参考文献 8
5羟色胺对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响
引言
引言
随着规模化和集约化养猪行业的发展，商品猪的育种工作导致瘦肉型商品猪的养殖成为主流，并且窝产仔数显著提高。我国是世界第一养猪大国和猪肉消费大国，养猪业能否健康、可持续发展是关乎国计民生的重要问题。母猪是养猪生产过程的核心群体，其生产性能的高低决定着养猪业的生产水平和经济效益。母乳可以说是为哺乳仔猪提供营养的唯一来源，母猪乳腺组织能否发育良好及泌乳功能能否正常启动关系着仔猪生长潜力的发挥、仔猪生长的上市体重及其上市时间[1]。乳由大部分水、脂肪、蛋白质、糖类、无机盐、维生素以及酶、激素等生物活性物质组成。脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）是哺乳动物脂肪酸从头合成过程的关键酶，哺乳动物肝脏和脂肪细胞胞液中及内质网内形成的其他脂肪酸可以进一步合成甘油三酯，而乳脂的主要成分源于甘油三酯。酪蛋白是乳中的主要乳蛋白,含有丰富的钙、磷。血液中的葡萄糖进入乳腺后经半乳糖合成乳糖，乳糖作为乳腺上皮细胞分泌的特有物质，在维持乳渗透压上起重要调节作用 [2]，其合成为启动泌乳的关键步骤直接影响乳产量。乳腺是各种乳成分合成与分泌的重要场所，乳腺从血液中选择性摄取乳成分前体物(milk component precursor，MCP)，MCP主要有游离氨基酸、小肽、乙酸、β羟丁酸和长链脂肪酸、葡萄糖。乳腺内乳蛋白质、乳糖和乳脂等乳成分的合成受乳成分前体物含量和组成的直接影响，进而影响乳的品质 [3]。研究表明，泌乳期间母猪机体内物质代谢旺盛，部分氨基酸供应不足可导致母猪泌乳能力下降及乳汁营养物质含量降低，导致哺乳期仔猪生长迟缓，发病率和死亡率增加[1]。因此，通过改善营养条件来提高母猪泌乳水平对于养猪业的发展具有重要意义。
5羟色胺（5hydroxytryptamine，5HT）最早是从血清中分离出的一种能引起外周血管收缩的物质，又称血清素，广泛存在于中枢和外周神经系统，是一种神经递质。目前的研究发现，其参与对疼痛、焦虑、抑郁、睡眠、体温、性活动、免疫、温度、营养吸收、攻击运动和多种摄食功能的调节。在中枢神经系统中，5HT参与多种生理功能及病理状态的调节，能使脑部的活动暂时受到抑制，使动物趋于安静，增进睡眠，有利于动物降低维持自身生理所需能量，促进生长，并能提高饲料的转化率。在外周组织中，5HT主要参与了胃肠运动、心血管生理功能的调节等。此外，5HT也是具有免疫调节作用的重要因子[4]，它能通过多种受体直接作用于各种免疫细胞，调节机体的免疫水平，是神经内分泌免疫调节网络中的重要组成部分。5HT由L色氨酸转化而来，而色氨酸作为乳蛋白的编码氨基酸，直接参与乳的合成。另外5HT具有调控钙离子分配的功能。钙离子作为很多信号传导过程中的第二信使，调节酶活性参与某些酶的代谢过程，从而可以影响乳蛋白、乳糖、乳脂的合成。另外，哺乳期间乳腺会从血液转运大量钙离子到乳中。
本试验将5HT作为研究对象，用5HT处理离体培养的乳腺上皮细胞，观察5HT对乳腺上皮细胞中FAS、乳糖合成酶（lactose synthetase，LS）、β酪蛋白（βCasein）含量的影响，研究其对乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。
1材料与方法
材料
1.1.1主要试剂 DMEM细胞培养液、胎牛血清购自于Gibco公司；EpH4Ev细胞购自于美国ATCC公司；猪乳腺上皮细胞购自于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司；5HT购自于Sigma公司；盐酸氟西汀分散片购自于PATHEON FRANCE（法国）公司；PrimScript RT Master Mix购自于TaKaRa公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自于Vazyme公司；PVDF膜购自于南京生兴生物公司；FAS、LS、βCasein、NAGase试剂盒购自于南京建成生物工程研究所；低分子量预染Marker购自于Pierce公司。其他试剂均为进口或国产公司分析纯。
1.1.2仪器 CO2细胞培养箱（Therm公司）；细胞倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；高速冷冻离心机（德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG）；UNIC型分光光度计（尤尼柯公司）；核酸浓度测定仪（Eppendorf Biophotometer）；荧光定量PCR仪（ABI Prism7300）；SDSPAGE凝胶转印槽（BioRad）；Mini TransBlot转印槽（BioRad）；电泳仪（BioRad）。
1. 2方法
1.2.1细胞的培养与处理 将处于对数生长期的原代猪乳腺上皮细胞及小鼠乳腺上皮细胞（EpH4Ev Mouse Mammary Epithelial Cells）分别以合适密度接种于六孔板，置于37℃、5%CO2条件下使用完全培养液（90%的上皮细胞专用培养基；1%的上皮细胞生长因子；10%的胎牛血清；1%的青霉素/链霉素；5ug/mL胰岛素；1ug/mL氢化可的松；5ng/mL表皮生长因子。）进行贴壁培养。待细胞长至80%融合时，饥饿处理12h，然后对细胞进行如下不同的处理：a、control；b、加5HT；c、同时加5HT和5HT摄取抑制剂（盐酸氟西汀溶液，selected serotonin reuptake inhibitors，SSRI）。两种乳腺上皮细胞均于24h时后收集细胞样品，或收集细胞悬液，或提取细胞总RNA，或提取细胞总蛋白。
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/51069.html
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